Summary
I denna video använder vi ett adenovirus bär Cre recombinase genen att infektera primära mus embryonala fibroblaster bär en floxed RAC1 allel.
Abstract
Möjligheten att genetiskt ta bort vissa komponenter i olika kaskader cellsignalering har varit en integrerad verktyg i modern signaltransduktion analys. En särskild metod för att uppnå detta villkorade raderingen är via användning av Cre-loxP systemet. Denna metod innebär flankerar den gen av intresse med loxP platser som är särskilt erkännande sekvenser för Cre recombinase protein. Exponering av floxed sk (flankerad av loxP webbplats) DNA till detta enzym resulterar i en Cre-medierad rekombination event på loxP platser, och efterföljande excision av mellanperioden gen 3. Flera olika metoder finns för att administrera Cre recombinase till platsen av intresse. I denna video visar vi att använda ett adenovirus som innehåller Cre recombinase genen att infektera primära mus embryonala fibroblaster (MEFs) som erhållits från embryon som innehåller en floxed RAC1 allel 1. Vårt motiv för att välja RAC1 MEFs för vårt experiment är att tydliga morfologiska förändringar kan ses vid radering av RAC1, på grund av förändringar i aktin cytoskelettet 2,5. 72 timmar efter virus transduktion och Cre uttryck, var cellerna färgas med aktin färgämnet phalloidin och avbildas med konfokalmikroskopi laserskanning. Det konstaterades att MEFs som hade utsatts för Adeno-Cre viruset dök kontrakterade och långsträckta i morfologi jämfört med oinfekterade celler, i linje med tidigare rapporter 2,5. Det adenovirus metod för Cre recombinase leverans är fördelaktigt eftersom Adeno-Cre viruset är lätt tillgängliga, och gendeletion via CRE i nästan 100% av cellerna kan uppnås med optimerade adenovirala infektion.
Protocol
Upptining av celler
- Skaffa frysta möss embryonala fibroblaster (MEFs) (genereras tidigare från enskilda embryo primära kulturer) från flytande kväve.
- Tina celler genom att sänka ner flaskan i 37 ° C vatten med virvlande tills innehållet är fullständigt tinats.
- Lägg till 9 ml av DMEM som har kompletterats med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin till en 10cm cellodling plattan.
- Tillsätt tinade cellsuspension droppvis till plattan, rock plattan försiktigt för att skingra celler och placera plattan i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator natten. Observera att om celler är känsliga för DMSO (från frysningen) kan initiala medier ersätts med nya media efter celler som har anslutit sig till plattan (cirka fyra timmar efter plätering). Observera också att sammanflödet av cellerna efter upptining beror på antalet av frysta celler, återvinningsgraden av cellerna efter frysning, och tillväxten av cellerna.
Passaging celler
- När cellerna har växt till i huvudsak 100% confluency (dvs. nästa dag), aspirera av media och tvätta cellerna med 5 ml sterilt PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 1 mL trypsin innehåller 10 mM EDTA och placera plattan i kuvös i ca 5 minuter så att cellerna att lossna från tallriken.
- När celler har lossnat, tillsätt 9 ml av media till trypsinized celler, pipett 2-3 gånger för att skingra klumpar, tillsätt 1 mL denna suspension droppvis på en ny platta som innehåller 9 ml av media, och placera denna i 37 ° C inkubator natten . Förekomsten av FBS i media kommer att inaktivera trypsin Alternativt kan celler tvättas först späda ut trypsin.
Räkning och plätering celler på täckglas
- Ta bort celler från inkubator, tvätta och trypsinize som förut, förutom den här gången lägga 5-6ml media tillbaka till trypsinized cellerna istället för 9 ml.
- Pipettera celler noggrant för att säkerställa fullständig dissociation till en enda cell fjädring och ta bort 15μL att kombinera med 15μL av trypan blå i en separat mikrofugrör.
- Blanda denna cell / trypan blå fjädring genom att pipettera upp och ned flera gånger, och lägga 15μL till hemocytometer.
- Under mikroskop, kommer döda celler visas blått. Räkna antalet klar / färglös (levande) celler i en av de 4X4 galler på hemocytometer. Upprepa detta räkna med tre andra 4X4 nät (betecknas A, B, C och D) och använder följande ekvation för att beräkna antal celler per mikroliter av fjädring:
- Genom protokollet optimering, har vi bestämt att bordläggningen 30.000 celler resultat från relevanta celltäthet för visualisering i slutet av experimentet.
- För att beräkna volymen av cellsuspension som behövs för 30.000 celler, använder du följande ekvation:
- Nu placera ett sterilt glida glaskupa i varje brunn i en sex väl tallrik och lägg 2 ml av media i varje brunn och lägg sedan till droppvis från din cellsuspension den volym som krävs för 30.000 celler i varje brunn. Observera att glas täckglas används för detta experiment som vi kommer att visualisera celler med hjälp av fluorescensmikroskopi vid en senare tidpunkt, inte alla program kommer nödvändigtvis mikroskopi och därmed täckglas inte kan krävas.
Virus Transduction
- Efter flera timmar eller över natten (tillräckligt med tid för att säkerställa att cellerna följer täckglas), ta bort media och tvätta cellerna med 1 mL serumfritt DMEM.
- Tillsätt 1 mL serum-fria medier i varje brunn för tillsättning av viruset. För detta experiment var Adeno-Cre virus erhållas kommersiellt från Vector Biolabs.
- Föregående protokoll optimering har visat att en mångfald av infektion (MOI) av 500 erbjuder effektiv genen transduktion i primära MEFs med liten eller ingen effekt på cellernas livskraft. MOI kan beräknas enligt följande:
- Tillsätt den beräknade volymen av virus direkt i varje brunn som ska smittas, skaka på plattan för att sprida virus och placera celler i 37 ° C inkubator över natten.
- Nästa morgon, ta bort viruset som innehåller material från cellerna och tvätta cellerna i 1 mL sterilt PBS och tillsätt sedan 2 ml av regelbundna media till varje brunn.
- I fallet med RAC1 cellerna exemplifieras i detta experiment, inträffade morfologiska förändringar i celler till cirka 72 timmar efter transduktion.
Representativa resultat
Celler visualiserad genom färgning med aktin dye phalloidin (för avbildning endast) och avbildas med Leica TCS-SP5 multiphoton konfokala laserskanning mikroskop vid Advanced Analysis Centre vid universitetet i Guelph. Figur 1 visar kontrakterade och långsträckta morfologi RAC1 flox / flox celler som utsattes för Adeno-Cre virus jämfört med samma celler som inte exponeras för viruset.
Figur 1. Jämförelse mellan RAC1 flox / flox celler infekterade med Adeno-Cre virus (vänster) jämfört med oinfekterade celler från samma källa (höger).
Discussion
Den medföljande video exemplifierar hur ett rekombinant virus kan användas för att punktskatt en specifik gen in vitro med hjälp av Cre recombinase. Utvecklingen av detta protokoll har dock avslöja några särskilda punkter värda att ta itu med.
- Korrekt säkerhetsrutiner skall alltid användas vid arbete med Adenovirus. En skyddsrock och handskar bör bäras vid alla tillfällen när du arbetar med viruset. Media och plastartiklar bör behandlas med 10% blekmedel i minst 30 minuter och plastartiklar skall autoklaveras därefter.
- Undvik upprepad frysning-tining av viruset beståndet eftersom detta kan påverka virus titer och därmed minska transduktion effektivitet. Små mängder av virus lager bör inledningsvis konstaterat i separata rör.
- MOIS allt från 50 till 500 testades under metodutveckling och effektiv transduktion priser observerades i de flesta fall, utan negativa effekter på cellernas livskraft.
- Adeno-GFP har också använts vid metodutveckling för att snabbt skärmen transduktion effektivitet. Denna kontroll (eller en tom vektor) bör ske under försöket för att säkerställa att virusinfektion ensam inte leder till cellförändringar. Likaså om excising den floxed genen av intresse i din cellerna inte leda till några cellförändringar (dvs. förändringar i morfologi eller livskraft), sedan infekterar samma cell typ med Adeno-GFP är en viktig kontroll som ska användas för att visa att viruset transduktion är inträffar.
Utöver granskningen av signalering kaskader i kultur, har Adeno-Cre tillvägagångssätt även varit anställd i vivo villkorligt bort gener från försöksdjur 3,4, och att märka vissa populationer av celler i en organism 6. Det adenovirus Systemet kan även anpassas för att introducera gener än Cre recombinase i värdceller. Två huvudsakliga fördelar med att använda denna leverans vektor är dess höga transduktion och genen leverans effektivitet och brist på integration med värd-DNA. Däremot kan den generation av nya rekombinanta Adenovirus vara arbetsintensiva. Protokollet som beskrivs här alltså utnyttjar kraften i den adenovirala systemet genom att utnyttja den tidigare utvecklade Adeno-Cre-virus, och kopplingen som med vår floxed allelen av intresse, RAC1. Genom denna villkorade slå ut experiment, har vi bekräftat att transduktion använder Adeno-Cre virus MEFs bär en floxed RAC1 allel faktiskt orsakar excision av RAC1 leder till förändringar av cellens morfologi kännetecknande för RAC1-brist celler 2,5.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av den kanadensiska rådet på Animal Care.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Rizaldy Scott vid Mount Sinai Hospital i Toronto, Ontario för hans gåva av den primära RAC1 flox / flox musen embryonala fibroblaster. Detta arbete stöddes av driftsbidrag till New Jersey från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009 till 93.526) och Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RG 327.372 till 06). SH och MW stöds av CGSMA och CGS-M utmärkelser från CIHR och NSERC, respektive.
Steve Hawley och Melanie Wills bidragit lika för detta dokument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
- Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).
- Rijnkels, M., Rosen, J. M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
- Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).
- Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).
