Summary
Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti per quantificare due turni successivi di divisione cellulare. Questa strategia è utile per rilevare il ricambio cellulare del longevo tessuti, la trasformazione oncogena, o di transito amplificazione cellule.
Abstract
Misurazione accurata della divisione cellulare è una sfida fondamentale in biologia sperimentale che diventa sempre più complesso, quando lentamente cellule in divisione vengono analizzati. Modalità stabilite per rilevare la divisione cellulare comprendono la visualizzazione diretta al microscopio continuo nelle cellule in coltura, la diluizione di coloranti vitali come carboxyfluorescein di-aetate succinimidile estere (CFSE), immuno-rivelazione di antigeni mitogenica come Ki67 o PCNA, e analoghi della timidina. Analoghi della timidina può essere rilevato da una varietà di metodi, compresa la radio-rilevamento per timidina triziata, immuno-rivelazione per bromo-deossiuridina (BrdU), cloro-deossiuridina (CldU) e iodo-deossiuridina (IDU), e individuazione di prodotti chimici per etinil-deossiuridina (UDE). Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di diversi analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti. Il nostro metodo consente agli investigatori di quantificare con precisione due turni successivi di divisione cellulare. Ottimizzando protocolli immunocolorazione il nostro approccio in grado di rilevare molto basso analoghi della timidina dose somministrata con l'acqua potabile, sicuri per i topi per periodi prolungati di tempo. Di conseguenza, la nostra tecnica può essere usata per rilevare il ricambio cellulare nei tessuti molto longevi. Ottimi risultati colorazione immunofluoresent può essere ottenuto in diversi tipi di tessuto, tra cui pancreas, cute, intestino, fegato, surrene, testicoli, ovaie, tiroide, linfonodi e nel cervello. Inoltre abbiamo applicato questa tecnica per identificare la trasformazione oncogena all'interno dei tessuti. Abbiamo inoltre applicato questa tecnica per determinare se il transito-amplificazione cellule contribuiscono alla crescita o il rinnovo dei tessuti. In questo senso, la somministrazione sequenziale di analoghi della timidina rappresenta un nuovo approccio per studiare le origini e la sopravvivenza delle cellule coinvolte nella omeostasi dei tessuti.
Protocol
1. I tessuti etichettatura con CldU e IDU
- Sciogliere analoghi della timidina (CldU o IDU) in acqua. Pesare mL 1mg / di ogni sostanza chimica e aggiungere a separare le bottiglie di vetro di acqua distillata. Noi di solito preparare 1 litro di ciascuno alla volta.
- Sciogliere i prodotti chimici su un piatto mescolare o altra forma di agitazione. CldU si dissolve in 10 min. di agitazione a temperatura ambiente. Idu richiede più di un'ora di agitazione a 37 ° C in uno shaker. Fonti d'acqua può influenzare la solubilità Idu. Se Idu rimane sospese durante la notte dopo agitazione, provare una fonte di acqua pulita. Le soluzioni sono conservati a 4 ° C al buio.
- Somministrare la prima soluzione contenente timidina (sia CldU o IDU) per i topi per il periodo desiderato etichettatura. Non lasciare che i topi di avere accesso all'acqua senza etichetta durante il periodo di etichetta. Al termine del periodo di etichettatura designato è stato completato, iniziare un washout senza etichetta con l'acqua per almeno 24 ore (il analoghi della timidina contenente siero hanno un'emivita di parecchie ore). Somministrare la seconda soluzione contenente timidina (sia CldU o IDU) per i topi per il periodo desiderato etichettatura. Bottiglie d'acqua ricarica regolarmente per prevenire la disidratazione!
- In alternativa, i topi possono essere etichettati con iniezione sequenziale intraperitoneale di CdlU e poi Idu. Preparare CldU o Idu a 10 mg / ml concentrazione. Idu può richiedere goccia a goccia di soluzione concentrata di idrossido di sodio seguito da agitazione violenta di andare in sospensione. Non aggiungere idrossido di sodio in eccesso. Aggiungere una sola goccia di idrossido di sodio a una soluzione 10 mL di Idu seguita da un'ora di agitazione a 37 ° C in uno shaker. Se non in soluzione, ripetere l'aggiunta di idrossido di sodio. Iniettare 100 mcg per g di peso corporeo nello spazio intraperitoneale.
- Vetrini di controllo sono essenziali per questo protocollo. Come risultato, si consiglia vivamente gli investigatori svolgono diverse varianti di etichettatura analogico timidina per assicurare la sensibilità e specificità. Queste dovrebbero includere 1. I topi che sono stati etichettati con solo CldU, 2. I topi che sono stati etichettati con solo Idu, 3. I topi che sono stati etichettati con CldU in sequenza e poi Idu, 4. I topi che sono stati etichettati in sequenza in ordine inverso, prima con IDU e poi CldU, 5 I topi che sono finte etichettati con sola acqua. Quando si impara ad etichettare con CldU e Idu, gli investigatori devono sempre effettuare l'intero protocollo con tutti i 5 set di sopra di vetrini di controllo dal tessuto di interesse.
2. Tessuto Harvest, Fissazione, e Slide Preparazione
- Utilizzando opportuni anestetico, eseguire overdose letali e poi sacrificio del mouse tramite dissanguamento. Rimuovere il tessuto fresco e fissare con il 4% paraformalehyde a 4 ° C per 24 ore. Trasferimento di tessuto al buffer 01:04 formalina e conservare a 4 ° C per l'incorporamento.
- In alternativa, eseguire overdose letali e poi profumato con il mouse attraverso il ventricolo cardiaco sinistro con soluzione fisiologica fino a quando il sangue viene eliminato dal corpo, poi subito profumato con 30-50 cc di paraformaldeide 4%. Rimuovere i tessuti di interesse e conservare in formalina Buffer 01:04 a 4 ° C per l'incorporamento.
- Dopo la disidratazione dei tessuti e in paraffina, tagliato a 5 micron sezioni di tessuto e del luogo su vetrini carica. Cuocere le diapositive a 65 ° C per 16 ore per assicurare l'adesione del tessuto a scivolare (essenziale con gradini recupero dell'antigene sotto).
3. Disidratazione, permeabilizzazione e Antigen Retrieval
- Rimuovere l'eccesso di paraffina immergendo le diapositive di due bagni xilene per 5 min. ciascuno.
- Reidratare il tessuto immergendo diapositive in etanolo diluito con acqua: 100, 95, 90, 80 70 e il 50%. Immergere i vetrini per 3 min. per ogni concentrazione, a partire da 100% e andando verso il 50% per l'immersione finale.
- Lavare i vetrini per 5 min. in 1x PBS.
- Permeabilize cellule immergendo le diapositive di 0,2% Triton-X soluzione per 5 minuti (preparata fresca ogni volta).
- Preparare i vetrini per il recupero dell'antigene tessuto microonde. Porre i vetrini in un bicchiere di vetro con un sufficiente volume di 0.01M pH 6,0 tampone di sodio citrato, in modo che la soluzione copre 5 cm sopra la parte superiore delle diapositive per tenere conto di perdite per evaporazione.
- Microonde diapositive fino a quando la soluzione è bollente (3-10 min. A piena potenza). Ridurre il potere fino a quando la soluzione sta lentamente bollente (10-80%) e proseguire per altri 20 min. Controllare periodicamente a microonde per assicurare la soluzione rimane a bollire lentamente.
- Coppa luogo contenente diapositive su un banco e lasciar raffreddare lentamente a temperatura ambiente (circa 2 ore).
- Confermare che scorre siano a temperatura ambiente con un termometro.
- Immergere i vetrini in 1.5N HCL per 40 min. a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte in PBS 1X, 5 min. a lavaggio.
4. Anticorpi primari e secondari
- E 'importante che le diapositive rimangono molto umido attraverso l'intero protocollo. Tessuti a secco avrà auto molto piùFluorescenza, rendendo le immagini risultanti inutilizzabile. Per evitare di morire, il processo di una diapositiva alla volta.
- Cerchio ogni sezione nelle diapositive con un liquido di blocco (cioè, cera) penna. Porre i vetrini nel contenitore di 1x PBS.
- Fai una camera umida incubazione mettendo fazzoletti di carta bagnati a piatto sul fondo di un contenitore ermetico di plastica.
- Make up soluzione bloccante di siero asino al 10% diluito in PBS 1x. E 'importante coprire interamente ogni sezione con la soluzione. Per le sezioni di tessuto che sono 1 x 1.5 centimetri, un volume di 50 micro-litri di soluzione per ogni sezione è sufficiente.
- Aggiungere la soluzione di blocco per le diapositive. Rimuovere il vetrino dalla PBS 1x ed eliminare i liquidi in eccesso picchiettando delicatamente il bordo scivolare su una pila di tovaglioli di carta a secco. Porre il vetrino nella camera di incubazione e aggiungere 50 micro-litri di soluzione di blocco al 10% per ogni sezione. Quando tutte le diapositive sono stati completati chiudere il contenitore ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Preparare prima diluizione degli anticorpi per rilevare Idu. Diluire topo anti-BrdU ad una concentrazione di 1:250 asino siero 5% made in 1x PBS. Rubinetto soluzione isolato da diapositive e posto nella camera di incubazione. Aggiungere l'anticorpo primario sopra a ciascuna sezione e incubare una notte a 4 ° C.
- Preparare lavare alto rigore (che riduce al minimo vincolante da topo anti-BrdU antisieri CldU). Make up fresco a basso tampone TBST sale (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0.5% Tween-20, pH 8,0). Avrete bisogno di 40 mL di tampone per ogni coppia di diapositive. Aggiungere 40 ml di tampone ad ogni provetta 50 ml conica. Prima di aggiungere diapositive, preriscaldare la soluzione a 37 ° C.
- Due alla volta, rimuovere le slide dalla camera di incubazione, metterli back-to-back (in modo che i campioni di tessuto viso lontano l'uno dall'altro) e toccare eccesso anticorpo primario. Porre i vetrini nei tubi riempiti con TBST iposodica e coprire. Agitare le provette per 20 min. in una agitazione batterica cultura incubatore con la temperatura a 37 ° C, e la velocità impostata a 225 giri al minuto.
- Lavare le diapositive due volte in acqua dolce PBS 1X. 5 min. a lavaggio.
- Preparare la soluzione successiva anticorpo primario per la rilevazione di CldU e l'antigene tissutale, se lo si desidera. Diluire ratto anti-BrdU ad una concentrazione di 1:250 asino siero 5% made in 1x PBS. Diluire antisieri primaria contro l'antigene di tessuto a lavorare concentrazione nella soluzione di anticorpo primario.
- Toccare l'eccesso di PBS 1x fuori delle diapositive, e metterli nella camera di incubazione. Aggiungere l'anticorpo primario per ogni sezione e incubare una notte a 4 ° C.
- Lavare le diapositive due volte in acqua dolce PBS 1X. 5 min. a lavaggio.
- Preparare la soluzione secondaria di anticorpi. Diluire Cy2 asino anti-ratto a 1:250 e Cy5 asino anti-topo a 1:500 in una soluzione 1X PBS contenente siero di asino al 5%. Aggiungi Cy3 secondaria per individuare le specie primaria di antisieri tessuto antigene. Inoltre, diluire un 0,4 mg / ml soluzione madre di DAPI a 1:150 in soluzione anticorpo secondario.
- Toccare eccesso 1X scivola via PBS e posto nella camera di incubazione. Aggiungere la soluzione secondaria di anticorpi a ciascuna sezione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le diapositive due volte in acqua dolce PBS 1X. 5 min. a lavaggio.
- Toccare l'eccesso di PBS 1X fuori delle diapositive e di aderire con copertura in vetro Prolungare Oro mezzi di montaggio anti-dissolvenza (NON usare Vectashield con coloranti dyanine!). Premere sul coprioggetto per eliminare le bolle d'aria. Conservare a 4 ° C.
5. Imaging e analisi
- L'immagine del tessuto di interesse con un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una sorgente di luce ad alta energia, piano-apocromatico obiettivi, e una macchina fotografica ad alta efficienza microscopio (ad esempio Hamamatsu Orca ER). Scatta foto in AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antigene tissutale) e Cy5 (IDU) canali. Unire immagini per creare un unico multi-layer file di immagine.
- Se eseguito correttamente, nuclei DAPI colorati saranno omogeneamente luminosa. Antigene tissutale (insulina ad esempio) dovrebbe rivelare le cellule di interesse. Se la colorazione con DAPI o tessuto-antigene è debole o inconsistente, scivolo immergere in PBS 1X durante la notte per rimuovere copertura antiscivolo e ripetere l'applicazione di antisieri secondari.
- Focus su antigeni tessuto Cy3. Controllare CldU e colorazione IDU in Cy2 e Cy5 canali, commutazione tra i canali. Cercare potenziale cross-reattività tra i marcatori, come indicato da un eccesso di IDU e CldU co-positività. Cercate tessuti che contengono solo CldU o Idu. La mancanza di nuclei CldU o IDU positivo può indicare un problema tecnico con etichettatura o colorazione. In questo caso, cercare un tessuto altamente replicativa (es. linfonodi nodo).
- Analizzare le immagini. Visualizzare i layer contenente DAPI e l'antigene tissutale. Con un pennarello bianco pensione in mano dominante e un contatore di cellule nella mano non dominante, contrassegnare ogni nucleo con un marchio in contrasto con un pennarello cancellabile (aka bianco marcatore bordo). Contare le celle DAPI positiva nel tessuto di interesse. Registrare il conteggio totale delle cellule. Utilizzare una gomma asciutto per rimuovere i segni. Display stratos contenente DAPI, l'antigene tissutale, e CldU. Contare le celle CldU positiva nel tessuto di interesse. Record CldU conta delle cellule, ma non cancellare i segni. Cambia display per visualizzare layer contenente l'antigene di tessuto, CldU e Idu. Conte CldU Idu cellule doppio positivo. Valore record, cancellare tutti i segni, e la visualizzazione strati contenenti DAPI, l'antigene tissutale, e Idu. Contare il numero totale delle cellule Idu positivo all'interno del tessuto di interesse. Record IDU conta delle cellule.
6. Rappresentante Risultati
Siamo in sequenza etichettati 6 settimane i topi di sesso femminile con età CldU per una settimana e poi IDU per due settimane, seguite da immediata sacrificio. Pancreas sono state colorate per rilevare CldU, Idu, e l'insulina (un antigene tessuto), così come DAPI. Isolotti erano uniformemente colorati con insulina. Nuclei CldU macchiato erano distinte da nuclei Idu macchiato (Figura 2). Molti nuclei al di fuori delle isole pancreatiche erano CldU Idu co-positivi (Figura 2, in basso a destra, frecce bianche). Una cellula di insulina solo positivo aveva colorazione nucleare sia per CldU e IDU (Figura 2, in basso a destra, freccia magenta).
Topi. Tutti gli esperimenti con i topi sono stati eseguiti secondo le linee guida del comitato IACUC dell'Ospedale dei Bambini di Philadelphia. Femmina B6.129 F1 topi wild-type sono stati acquistati dalla Taconic (Germantown New York), ospitato presso l'impianto di animali di laboratorio presso l'ospedale pediatrico di Filadelfia, e nutriti mouse Dieta 5015 da PMI Nutrition International (Richmond. Indiana).
Etichettatura strategia. Mediante l'etichettatura il primo evento divisione cellulare con CldU (contrassegnati in verde questo regime) e la divisione cellulare secondo con Idu (marcata in rosso in questo schema), sequenziale divisione risultati cellulare in co-etichettati cellule con entrambi CldU e IDU (verde / rosso) .
Risultati rappresentativi di etichettatura timidina del fatturato delle cellule pancreatiche nei topi. Immunofluorescenza immagine di un pancreas mouse con isolotto di Langerhans nel centro. Mouse è stato infuso con CldU per 1 settimana e poi IDU per 2 settimane in acqua potabile prima del sacrificio immediato. Campione del pancreas è stato elaborato come descritto nel protocollo. 40x immagini oggettive, con strati distinti visualizzati adatto per il conteggio. Immagini fuse contengono DAPI (bianco) CldU (verde), IDU (rosso), insulina (giallo). (In alto, a sinistra) DAPI e insulina. (In alto, a destra) CldU e insulina. (In basso, a sinistra) IDU e insulina. (In basso, a destra) CldU, Idu, e insulina. Scala grafica: 100μm.
Figura 1. Strategia di etichettatura. Mediante l'etichettatura il primo evento divisione cellulare con CldU (contrassegnati in verde questo regime) e la divisione cellulare secondo con Idu (marcata in rosso in questo schema), sequenziale divisione risultati cellulare in co-etichettati cellule con entrambi CldU e IDU (verde / rosso) .
Figura 2. I risultati rappresentativi di etichettatura timidina del fatturato delle cellule pancreatiche nei topi. Immunofluorescenza immagine di un pancreas mouse con isolotto di Langerhans nel centro. Mouse è stato infuso con CldU per 1 settimana e poi IDU per 2 settimane in acqua potabile prima del sacrificio immediato. Campione del pancreas è stato elaborato come descritto nel protocollo. 40x immagini oggettive, con strati distinti visualizzati adatto per il conteggio. Immagini fuse contengono DAPI (bianco) CldU (verde), IDU (rosso), insulina (giallo). (In alto, a sinistra) DAPI e insulina. (In alto, a destra) CldU e insulina. (In basso, a sinistra) IDU e insulina. (In basso, a destra) CldU, Idu, e insulina. Scala grafica: 100μm.
Discussion
Il nostro approccio alla timidina approccio di etichettatura turn-over cellulare ha molte potenziali applicazioni nella ricerca biomedica. Fino ad oggi, ci siamo concentrati sul pancreas, ma abbiamo anche applicato questa strategia di esaminare ricambio cellulare della pelle, intestino, fegato, surrene, rene, testicoli, ovaie, tiroide, linfonodi, ematopoiesi, e il cervello 1. Perché il turnover cellulare varia da tessuto a tessuto, le strategie di etichettatura devono essere personalizzati per ottenere le informazioni più interessanti dall'organo di interesse. Morrison e colleghi hanno usato CldU e IDU per 1 giorno per ogni etichetta ematopoiesi 2. Kuhn e colleghi usare CldU e IDU per 4 giorni ciascuno per rilevare la divisione cellulare nel rigenerare miocardio 3. Al contrario, abbiamo usato CldU e Idu fino a 9 mesi di etichettare fatturato totale delle cellule basali in isole pancreatiche, un tessuto con un fatturato minimo di cellule con l'invecchiamento animale 1,4-6. L'applicazione più ovvia potenziale della nostra strategia di etichettatura per gli studi per definire il turnover cellulare all'interno di omeostasi dei tessuti. Ma la nostra tecnica ha diverse altre applicazioni potenziali. Ad esempio, abbiamo anche recentemente applicato questa tecnica per identificare la trasformazione oncogena nei tessuti, dove aree focali di replica maggiore possono essere facilmente identificati per incorporazione aumentata di CldU o IDU 5. Morrison e colleghi hanno usato CldU e IDU per 1 giorno ciascuno per verificare il comportamento etichetta mantenendo di cellule staminali ematopoietiche 2. Abbiamo anche applicato sequenziale etichettatura analogico timidina per determinare se il transito-amplificazione cellule contribuiscono alla crescita o il rinnovo dei tessuti 1. In questa amministrazione applicazione sequenziale di analoghi della timidina rappresenta un nuovo approccio per studiare le origini e la sopravvivenza delle cellule coinvolte nella omeostasi dei tessuti.
Analoghi della timidina non deve essere usato senza cautela. Analoghi della timidina sintetiche hanno tossicità potenziale di cellule in divisione, e il loro uso potrebbe teoricamente mettere in pericolo il rinnovamento cellulare negli animali in sviluppo. Analoghi della timidina sono stati utilizzati come radiosensibilizzante agenti per i malati di cancro, e può rallentare il turnover cellulare. Quindi chiediamo agli investigatori di indagare con cautela a causa della tossicità potenziale a loro tessuto di interesse. Per esempio, Trumpp e colleghi hanno trovato che sistemica BrdU può forzare le cellule staminali ematopoietiche per entrare ciclo cellulare 7. Per esempio, Rutter e colleghi hanno osservato che alte dosi analoghi della timidina sono tossici per lo sviluppo del pancreas 8. Più recentemente Hellerstein e colleghi KineMed, Inc ha scoperto che la somministrazione di BrdU rallenta intra-isolotto proliferazione 16-25% utilizzando una tecnica proprietaria pesante etichettatura acqua 9. I preparativi isolotto tutto usato da Hellerstein e colleghi contenute molte endocrini e altri tipi di cellule non-endocrino, che potrebbe comprendere anche il 50% di preparati isolotto totale. Tuttavia, troviamo che l'infusione prolungata di BrdU non influenza la proliferazione delle cellule beta nei topi giovani adulti, come misurato da Ki67 espressione 4. Allo stesso modo, a lungo termine e di somministrazione di CldU Idu non sembra pregiudicare l'espansione di massa delle cellule beta 1. Inoltre, i tassi di proliferazione delle cellule beta sono equivalenti tra topi etichettati con BrdU per lunghi periodi di tempo e di topi che sono solo etichettato per qualche ora (le tariffe sono normalizzati a periodi di tempo equivalente). Insieme, questi risultati suggeriscono che i topi possono tranquillamente tollerare a lungo termine a basso dosaggio somministrazione di analoghi della timidina. Eppure, non possiamo escludere la potenziale tossicità di analoghi della timidina nella crescita delle cellule beta pancreatiche. Di conseguenza, continuiamo ad eseguire i controlli per l'etichettatura topi con analoghi della timidina, e invitiamo altri investigatori a fare altrettanto.
La nostra tecnica di etichettatura sequenziale analogico timidina non sia esente da rischi e le sfide tecniche. Di conseguenza, vetrini di controllo sono particolarmente importanti. Abbiamo generato vetrini di controllo che consistono di vari tessuti da 1) I topi che erano solo etichettati con CldU;.. 2) I topi che erano solo etichettati con IDU;. 3) I topi che sono stati etichettati in modo sequenziale con CldU e poi IDU;. 4) I topi che sono stati etichettati in sequenza in ordine inverso, prima con IDU e poi CldU;. 5) I topi che sono finte etichettati con sola acqua. Quando si impara ad etichettare con CldU e Idu, gli investigatori devono sempre effettuare l'intero protocollo con tutti i 5 set di sopra di diapositive dal tessuto di interesse.
Lieve reattività crociata tra CldU e Idu è un aspetto negativo sfortunato ma inevitabile per l'etichettatura con entrambi analoghi della timidina. La tecnica CldU e Idu si basa su differenze di affinità tra antisieri che erano originariamente derivati contro BrdU in diverse specie (topo e ratto). Il nostro protocollo, mentre ingombrante, è progettato per minimizzare tale reattività crociata. Di conseguenza, invitiamo i cautela tra gli investigatori che considerano saltare passo (s) del protocollo. In particolare, abbiamoavuto problemi con antisieri secondari che sono reattivi croce in mezzo topo e ratto. Questo può essere minimizzato con l'uso di antisieri Jackson che sono completamente cross-adsorbito in mezzo topo e ratto.
Noi a volte non riescono a rilevare in modo adeguato timidina. In questi casi è estremamente importante utilizzare vetrini di controllo positivo per determinare quale reagente o passo non funzionava. Le difficoltà sono in genere a causa di cattiva aliquote di antisieri, diapositive a secco, o inadeguata permeabilizzazione nucleare. Non siamo riusciti a sviluppare con successo etichetta embrioni con Idu. Quindi, non tutti i tessuti possono essere permeabile al Idu.
Alternative alla CldU e Idu per il doppio etichettatura analogico timidina sono all'orizzonte. EdU (5-etinil-2 deossiuridina) può essere un substrato per la rilevazione chimica catalizzata in rame clicca 10,11. Metodi di rilevamento EdU non richiedono la separazione dei filamenti di DNA, e sono quindi altamente suscettibili di analisi del 12 citometria a flusso. Edu è compatibile, ma non a reazione crociata con BrdU 10. EdU è stato utilizzato per quantificare il ricambio cellulare dei tessuti del mouse vari tra cui le cellule beta pancreatiche 13, le cellule intestinali L epidermide 14 e 15. Edu è abbastanza costoso per il momento ($ 1000 dollari a 500mg). Ancora, la rilevazione Edu sembra essere molto più sensibili di BrdU rilevamento 10. Quindi, potrebbe essere economicamente fattibile per combinare Edu e BrdU invece di CldU e Idu. Questo metodo può inoltre consentire l'individuazione di tre turni diversi di divisione cellulare nei topi triplamente etichettati per EdU, CldU e Idu.
In sintesi, la nostra tecnica di etichettatura sequenziale analogico timidina è un nuovo approccio per la rilevazione turn-over cellulare. Ci auguriamo che il nostro approccio consente agli scienziati di altri per quantificare con maggiore precisione la divisione cellulare, e ci aspettiamo che si aprirà nuovi paradigmi in omeostasi dei tessuti.
Disclosures
Tutti gli esperimenti con i topi sono stati eseguiti nella struttura animale presso l'ospedale pediatrico di Filadelfia secondo le linee guida della cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC).
Acknowledgments
Sostenuto dalla JDRF, il NIH (R01-DK081469), il Commonwealth della Pennsylvania (Centro di Eccellenza in Medicina Rigenerativa concedere 4100043362), il March of Dimes (Basilio O'Connor Starter Research Scholar Award), e della University of Pennsylvania pilota DERC e fattibilità di sovvenzione (DK19525).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 0210547891 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedicals | 0210035701 | |
| 4% Paraformaldehyde | USB Corp., Affymetrix | 19943 | |
| 10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| XYLENES | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Hydrochloric Acid | VWR international | BDH3028-2.5LG | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Mouse Anti BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical & Scientific Corporation | OBT0030 | |
| Cy2 donkey anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). |
| Cy5 donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | See above |
| Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | |
| YFP Filter | Chroma Technology Corp. | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel |
| Cy3 Filter | Chroma Technology Corp. | 49004 ET Cy3 | |
| Cy5 Filter | Chroma Technology Corp. | 49006 ET Cy5 | |
| ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu Corp. | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |
References
- Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).
- Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).
- Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
- Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. , (2009).
- He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. , (2009).
- Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).
- Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).
- Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).
- Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).
- Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).
- Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).
- Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).
- Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).
- Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).
- Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).
- Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).
