Summary
وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة لتحديد جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. هذه الاستراتيجية مفيدة للكشف عن دوران خلية من خلايا أنسجة طويلة الأمد ، والتحول أنكجنيك أو خلايا العبور تضخيم.
Abstract
القياس الدقيق للانقسام الخلية هو التحدي الأساسي في مجال البيولوجيا التجريبية التي تزداد تعقيدا عندما يصبح يتم تحليل الخلايا ببطء الانقسام. الوسائل المتبعة للكشف عن انقسام الخلايا وتشمل التصور المجهري المباشر المستمر في الثقافة الخلية ، التخفيف من الأصباغ حيوية مثل succinimidyl carboxyfluorescein استر دى aetate (CFSE) ، المناعية كشف المستضدات مولد للتفتل مثل ki67 أو PCNA ، ونظائرها ثيميدين. ويمكن الكشف عن نظائرها ثيميدين جانب مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك الكشف عن الراديو لثيميدين معالج بالتريتيوم ، المناعية الكشف عن برومو deoxyuridine (BrdU) ، اللون الأخضر deoxyuridine (CldU) وiodo deoxyuridine - (إيدو) ، والكشف عن المواد الكيميائية لdeoxyuridine - استراديول (ايدو). وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين مختلفة (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة. لدينا وسيلة تسمح للمحققين لتحديد بدقة جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. عن طريق تحسين بروتوكولات immunostaining يمكن الكشف عن نهجنا منخفضة جدا نظائرها ثيميدين الجرعة المعطاة عن طريق مياه الشرب ، وآمنة لإدارة مجموعة من الفئران لفترات طويلة من الزمن. وبالتالي ، يمكن استخدام التقنية لدينا لكشف الخلية في الأنسجة دوران جدا طويلة الأمد. ويمكن تحقيق النتائج المثلى تلطيخ immunofluoresent في أنواع الأنسجة المتعددة ، بما في ذلك البنكرياس والجلد والأمعاء والكبد والغدة الكظرية والخصية والمبيض والغدة الدرقية والعقدة اللمفاوية ، والدماغ. لقد طبقنا هذه التقنية أيضا لتحديد التحول أنكجنيك داخل الأنسجة. لقد طبقنا مزيد من هذه التقنية لتحديد ما إذا كان العبور تضخيم الخلايا تساهم في النمو أو تجديد الأنسجة. في هذا المعنى ، ادارة متسلسلة من نظائرها ثيميدين يمثل نهجا جديدا لدراسة أصول وبقاء الخلايا المشاركة في توازن الأنسجة.
Protocol
1. وضع العلامات ومناديل مع CldU إيدو
- حل نظائرها ثيميدين (CldU أو إيدو) في الماء. تزن مل 1mg / من كل مادة كيميائية وإضافة لفصل الزجاجات من الماء المقطر. نحن نستعد عادة 1 ليتر لكل في وقت واحد.
- تذوب المواد الكيميائية على طبق من إثارة أو أي شكل آخر من المحرض. CldU سوف تذوب في 10 دقيقة. التحريض في درجة حرارة الغرفة. إيدو يتطلب أكثر من ساعة من الإثارة عند 37 درجة مئوية في شاكر. يمكن أن تؤثر على مصادر المياه إيدو الذوبان. إذا كان لا يزال إيدو إلغاء تعليق بعد المصافحة بين عشية وضحاها ، في محاولة أنظف مصدر للمياه. يتم تخزين الحلول على 4 درجات مئوية في الظلام.
- إدارة الحل الأول الذي يحتوي ثيميدين (إما أو CldU إيدو) للفئران لفترة الوسم المطلوب. لا تسمح الفئران في الحصول على مياه غير المسماة خلال الفترة من التسمية. عندما يتم الانتهاء من وضع العلامات الفترة المعينة ، والبدء في الغسل بالماء الخالي من الملصقات على الأقل 24 ساعة (ونظائرها ثيميدين يحتوي المصل ونصف حياة عدة ساعات). إدارة حل ثيميدين ثانية تحتوي على (إما أو CldU إيدو) للفئران لفترة الوسم المطلوب. إعادة ملء زجاجات المياه بانتظام لمنع الجفاف!
- بدلا من ذلك ، يمكن أن توصف الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق متتابعة من CdlU ثم تعاطي المخدرات بالحقن. إعداد CldU أو إيدو في 10mg / مل التركيز. إيدو قد تتطلب ترك الحكمة إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم تتركز تليها تهز قوية للذهاب الى تعليق. لا تقم بإضافة هيدروكسيد الصوديوم الزائدة. إضافة قطرة واحدة من هيدروكسيد الصوديوم في التوصل إلى حل 10 مل من إيدو تليها ساعة من الإثارة عند 37 درجة مئوية في شاكر. إن لم يكن في حل ، كرر إضافة هيدروكسيد الصوديوم. حقن 100mcg في وزن الجسم ز الى الفضاء داخل الصفاق.
- الشرائح السيطرة ضرورية لهذا البروتوكول. نتيجة لذلك ، نقترح بشدة قيام المحققين اختلافات عدة من العلامات التماثلية ثيميدين لضمان حساسية وخصوصية. وينبغي أن تشمل هذه 1. الفئران التي وصفت فقط مع CldU ؛ 2. الفئران التي وصفت فقط مع إيدو ؛ 3. الفئران التي وصفت بالتتابع مع CldU وإيدو ثم 4. الفئران التي وصفت بالتسلسل في ترتيب عكسي ، أولا مع إيدو وCldU ثم (5) ؛ الفئران التي هي وهمية المسمى مع الماء فقط. عندما تعلم أن التسمية مع CldU وإيدو ، وينبغي للمحققين يحمل دائما خارج البروتوكول كامل مع جميع مجموعات من الشرائح 5 أعلاه التحكم من الأنسجة من الاهتمام.
2. حصاد الأنسجة ، والتثبيت ، وإعداد الشرائح
- باستخدام التخدير المناسبة ، نفذ جرعة زائدة قاتلة ثم التضحية الماوس عبر استنزاف. إزالة أنسجة جديدة وإصلاح paraformalehyde مع 4 ٪ في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. نقل الأنسجة العازلة 01:04 الفورمالين وتخزينها في 4 درجات مئوية لتضمينها.
- بدلا من ذلك ، نفذ جرعة زائدة قاتلة ثم يروي الماوس عبر البطين الأيسر في القلب مع المحلول الملحي حتى يتم مسح الدم من الجسم ، ثم يروي فورا مع 30-50 سم مكعب من بارافورمالدهيد 4 ٪. إزالة أنسجة الفائدة وتخزينها في مخزن 01:04 الفورمالين في 4 درجات مئوية عن التضمين.
- بعد جفاف الأنسجة وتضمينها البارافين ، وقطع النسيج المقاطع 5 ميكرون ومكان على الشرائح المشحونة. خبز الشرائح عند 65 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لضمان التصاق الأنسجة لشريحة (الخطوات الأساسية مع استرجاع مستضد أدناه).
3. الجفاف ، Permeabilization ، واسترجاع مستضد
- إزالة الزائدة البارافين بغمر الشرائح في اثنين من حمامات الزيلين لمدة 5 دقائق. لكل منهما.
- ترطيب الأنسجة بغمر الشرائح في الإيثانول المخفف بالماء : 100 ، 95 ، 90 ، 80 70 و 50 ٪. نقع الشرائح لمدة 3 دقائق. في كل التركيز ، بدءا من 100 ٪ ويذهب نحو 50 ٪ للغمر النهائي.
- تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق. 1X في برنامج تلفزيوني.
- Permeabilize الخلايا بغمر الشرائح في حل تريتون - X 0.2 ٪ لمدة 5 دقائق (مصنوعة جديدة في كل مرة).
- تحضير الشرائح للأنسجة الميكروويف استرجاع مستضد. ضع الشرائح في دورق زجاجي بحجم 6.0 درجة الحموضة كافية 0.01M العازلة سيترات الصوديوم ، بحيث يغطي الحل 5 سم فوق الجزء العلوي من الشرائح لحساب خسارة التبخر.
- الميكروويف الشرائح حتى الغليان الحل هو (3-10 دقيقة. في السلطة الكاملة). تقليل استهلاك الطاقة حتى حل يغلي ببطء (10-80 ٪) ويستمر لدقائق و 20 إضافية. الاختيار الميكروويف دوريا لضمان الحل لا يزال يغلي في بطء.
- دورق مكان يحتوي على الشرائح العليا مقاعد البدلاء ، والسماح لتبرد برفق إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 2 ساعة).
- تأكد من أن الشرائح هي في درجة حرارة الغرفة باستخدام ميزان حرارة.
- تزج الشرائح في HCL 1.5N لمدة 40 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني 1X ، 5 دقائق. في غسل.
4. الابتدائي والثانوي الأضداد
- من المهم أن تبقى الشرائح رطبة جدا من خلال بروتوكول بأكمله. سوف الأنسجة الجافة والسيارات أكثر من ذلك بكثيرومضان ، مما ينتج عنها من الصور غير صالحة للاستعمال. لمنع الموت ، وعملية شريحة واحدة في وقت واحد.
- دائرة كل قسم على الشرائح مع سائل منع (أي الشمع) القلم. مكان الشرائح مرة أخرى في حاوية PBS 1X.
- جعل غرفة الحضانة الرطبة عن طريق وضع مناشف ورقية مبللة وضعت شقة في الجزء السفلي من وعاء بلاستيكي محكم.
- تشكل الحل حجب المصل حمار 10 ٪ المخفف في برنامج تلفزيوني 1X. من المهم تماما لتغطية كل قسم مع الحل. لقطاعات الأنسجة التي هي 1 × 1.5 سم ، وبلغ حجم التداول الدقيقة 50 لترا من محلول في القسم كاف.
- إضافة إلى عرقلة حل الشرائح. إزالة شريحة من برنامج تلفزيوني 1X والقضاء على السائل الزائد عن طريق التنصت على حافة الشريحة بلطف على كومة من المناشف الورقية الجافة. الشريحة مكان في غرفة الحضانة وإضافة الدقيقة 50 لترا من حل كتلة من 10 ٪ إلى كل قسم. عندما يتم الانتهاء من كافة الشرائح إغلاق الحاويات ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- إعداد الأولية للكشف عن الأجسام المضادة تخفيف إيدو. تمييع الماوس المضادة للBrdU بتركيز 1:250 في المصل حمار 5 ٪ المحرز في برنامج تلفزيوني 1X. الحنفية حل كتلة من شريحة والمكان مرة أخرى إلى غرفة الحضانة. إضافة الأضداد المذكورة أعلاه على كل قسم الابتدائي واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إعداد عالية غسل التقشف (الذي يقلل ملزمة أمصال مضادة لمكافحة BrdU الماوس لCldU). تشكل الطازجة TBST الملح منخفضة العازلة (36mM تريس ، 50mM كلوريد الصوديوم ، و 0.5 ٪ توين - 20 ؛ 8.0 درجة الحموضة). سوف تحتاج 40 مل من العازلة لكل زوج من الشرائح. إضافة 40 مل من كل أنبوب عازلة لمخروطية 50 مل. قبل إضافة الشرائح ، وتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية.
- اثنين في وقت واحد ، وإزالة الشرائح من غرفة الحضانة ، وضعها مرة أخرى إلى الوراء (بحيث عينات الأنسجة الوجه بعيدا عن بعضها البعض) ، والحنفية الأجسام المضادة الأولية الزائدة. ضع الشرائح في أنابيب مملوءة TBST الملح منخفضة والغطاء. تستنهض الهمم الأنابيب لمدة 20 دقيقة. في مئوية تهز البكتيرية حاضنة الثقافة مع درجة الحرارة 37 ، وسرعة تعيين إلى 225 دورة في الدقيقة.
- تغسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة. 5 دقائق. في غسل.
- إعداد المقبل حل الأولية للكشف عن الأجسام المضادة للمستضد CldU والأنسجة ، وإذا رغبت في ذلك. تمييع لمكافحة الفئران BrdU بتركيز 1:250 في المصل حمار 5 ٪ المحرز في برنامج تلفزيوني 1X. تمييع أمصال مضادة ضد مستضد النسيج الأساسي في العمل تركيز الضد في الحل الأساسي.
- اضغط الزائدة 1X PBS الخروج من الشرائح ، ووضعها في غرفة الحضانة. إضافة إلى الأجسام المضادة الأولية لكل قسم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تغسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة. 5 دقائق. في غسل.
- إعداد الحل الضد الثانوية. تمييع Cy2 حمار لمكافحة الجرذان و1:250 Cy5 حمار مكافحة الماوس إلى 1:500 في محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني 1X 5 ٪ المصل حمار. إضافة Cy3 الثانوية للكشف عن الأنواع الرئيسية للأمصال مضادة مستضد الأنسجة. أيضا ، وتمييع الحل الأسهم 0.4mg / مل من دابي إلى 1:150 في محلول الأجسام المضادة الثانوية.
- اضغط الزائد 1X PBS الشرائح ووضعه في غرفة الحضانة. إضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية حل كل قسم واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة. 5 دقائق. في غسل.
- اضغط الزائدة 1X PBS الخروج من الشرائح الزجاجية والالتزام مع إطالة غطاء الذهب تتلاشى وسائل الإعلام المعادية للتصاعد (لا تستخدم مع Vectashield الأصباغ dyanine!). اضغط على زلات تغطية للقضاء على فقاعات الهواء. المحل في 4 درجات مئوية.
5. التصوير والتحليل
- صورة نسيج من المصالح مع المجهر الفلورسنت مجهزة مصدر الطاقة الضوئية عالية ، خطة - اللازيغية الأهداف ، وكفاءة عالية المجهر الكاميرا (مثلا هاماماتسو أوركا ER). التقاط الصور في AMCA (دابي) ، Cy2 (CldU) ، Cy3 (مستضد الأنسجة) ، وقنوات Cy5 (إيدو). دمج الصور إلى إنشاء ملف صورة واحدة متعددة الطبقات.
- إذا أجريت بشكل صحيح ، فإن نوى دابي الملون يكون مشرقا متجانس. وينبغي أن مستضد الأنسجة (مثل الأنسولين) تكشف عن خلايا الفائدة. إذا تلطيخ مع دابي أو الأنسجة مستضد ضعيفة أو غير متناسقة ، الشريحة تزج في برنامج تلفزيوني 1X بين عشية وضحاها لإزالة الغطاء زلة وكرر الطلب من أمصال مضادة الثانوية.
- التركيز على مستضد الأنسجة في Cy3. الاختيار CldU وإيدو في تلطيخ Cy2 Cy5 والقنوات ، وتبديل بين القنوات. البحث عن إمكانات التفاعل المتبادل بين علامات ، كما يتبين من إيدو المفرطة وشارك في CldU بالفيروس. بحث عن الأنسجة التي تحتوي على CldU فقط أو تعاطي المخدرات بالحقن. قد نقص أو النوى CldU إيدو إيجابية تشير إلى وجود مشكلة فنية مع وضع العلامات أو تلطيخ. في هذه الحالة ، ابحث عن منديل تنسخي للغاية (على سبيل المثال العقدة الليمفاوية).
- تحليل الصور. عرض طبقات تحتوي على مستضد دابي والأنسجة. باستخدام علامة وحة بيضاء في اليد المهيمنة ومكافحة خلية في اليد غير المهيمنة ، وعلامة كل نواة مع علامة المتناقضة مع علامة محو الجافة (الملقب علامة وحة بيضاء). عدد الخلايا دابي إيجابية داخل الأنسجة من الاهتمام. سجل إجمالي عدد الخلايا. استخدام الممحاة لإزالة علامات الجافة. عرض طبقةق تحتوي دابي ، مستضد الأنسجة ، وCldU. عدد الخلايا CldU إيجابية داخل الأنسجة من الاهتمام. سجل تعداد خلايا CldU لكن لا يمحو علامات. تغيير عرض لتصور طبقات تحتوي على مستضد الأنسجة ، CldU ، وتعاطي المخدرات بالحقن. عدد الخلايا CldU إيدو ايجابية مزدوجة. قيمة قياسية ، محو جميع العلامات ، وعرض الطبقات التي تحتوي على دابي ، مستضد الأنسجة ، وتعاطي المخدرات بالحقن. احصاء العدد الكلي للخلايا إيدو إيجابية داخل أنسجة الفائدة. سجل العد إيدو الخلية.
6. ممثل النتائج
نحن المسمى الأسبوع بالتسلسل 6 إناث الفئران القديمة مع CldU لمدة أسبوع ومن ثم تعاطي المخدرات بالحقن لمدة أسبوعين ، تليها التضحية فورا. وكانت ملطخة بنكرياسات للكشف عن CldU ، إيدو ، والانسولين (أ مستضد الأنسجة) ، فضلا عن دابي. وكانت ملطخة موحد الجزر مع الانسولين. كانت نواة ملطخة CldU متميزة من نوى إيدو الملون (الشكل 2). وكانت العديد من النوى خارج جزيرة CldU إيدو التعاون الإيجابي (الشكل 2 ، أسفل اليمين ، والسهام البيضاء). وكان وحيد الخلية الأنسولين الإيجابي تلطيخ النووية لكلا CldU وإيدو (الشكل 2 ، أسفل اليمين ، السهم الأرجواني).
الفئران. أجريت جميع التجارب على الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة IACUC من مستشفى الاطفال في فيلادلفيا. تم شراؤها الإناث B6.129 F1 البرية من نوع من الفئران Taconic (جيرمانتاون نيويورك) ، ومقره في المختبر مرفق الحيوانية في مستشفى الاطفال في فيلادلفيا ، وتغذية حمية ماوس 5015 من الصليب الاحمر الدولي للتغذية (Richmond. انديانا).
العلامات الاستراتيجية. بواسطة وسم أول حدث انقسام الخلايا مع CldU (علامة خضراء في هذا النظام) ، وانقسام الخلية الثانية مع إيدو (علامة حمراء في هذا المشروع) ، متتابعة نتائج الانقسام الخلوي في الخلايا المسمى المشترك مع كل من إيدو وCldU (أخضر / أحمر) .
ممثل نتائج الوسم ثيميدين دوران خلية البنكرياس داخل الفئران. مناعي صورة الفأر مع البنكرياس جزيرة لانجرهانز في المركز. وقد غرست الفأر مع CldU ل1 أسبوع ثم إيدو لمدة 2 أسابيع في مياه الشرب قبل أن يضحي على الفور. فقد تم تجهيز عينة البنكرياس كما هو موضح في البروتوكول. عرض الصور 40X الهدف ، مع طبقات متميزة مناسبة لفرز الأصوات. الصور المدمجة تحتوي دابي (أبيض) CldU (الأخضر) ، إيدو (الحمراء) ، الأنسولين (الصفراء). (العلوي ، يسار) ودابي الانسولين. (العلوي ، يمين) وCldU الأنسولين. (أقل واليسار) وتعاطي المخدرات بالحقن الأنسولين. (الجزء السفلي ، يمين) CldU ، إيدو ، والأنسولين. شريط النطاق : 100μm.
الشكل 1. استراتيجية وصفها. بواسطة وسم أول حدث انقسام الخلايا مع CldU (علامة خضراء في هذا النظام) ، وانقسام الخلية الثانية مع إيدو (علامة حمراء في هذا المشروع) ، متتابعة نتائج الانقسام الخلوي في الخلايا المسمى المشترك مع كل من إيدو وCldU (أخضر / أحمر) .
الشكل 2. نتائج ممثل العلامات ثيميدين دوران خلية البنكرياس داخل الفئران. مناعي صورة الفأر مع البنكرياس جزيرة لانجرهانز في المركز. وقد غرست الفأر مع CldU ل1 أسبوع ثم إيدو لمدة 2 أسابيع في مياه الشرب قبل أن يضحي على الفور. فقد تم تجهيز عينة البنكرياس كما هو موضح في البروتوكول. عرض الصور 40X الهدف ، مع طبقات متميزة مناسبة لفرز الأصوات. الصور المدمجة تحتوي دابي (أبيض) CldU (الأخضر) ، إيدو (الحمراء) ، الأنسولين (الصفراء). (العلوي ، يسار) ودابي الانسولين. (العلوي ، يمين) وCldU الأنسولين. (أقل واليسار) وتعاطي المخدرات بالحقن الأنسولين. (الجزء السفلي ، يمين) CldU ، إيدو ، والأنسولين. شريط النطاق : 100μm.
Discussion
نهجنا في ثيميدين النهج القائم على وضع العلامات دوران الخلية والعديد من التطبيقات المحتملة في مجال البحوث الطبية الحيوية. حتى الآن ، فقد ركزنا على البنكرياس ، ولكن علينا أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لدراسة دوران خلية من خلايا الجلد والأمعاء والكبد والكلى الغدة الكظرية ، والخصية والمبيض والغدة الدرقية والعقدة الليمفاوية ، تكون الدم والمخ 1. لأن دوران الخلية يختلف من الأنسجة إلى الأنسجة ، ينبغي وضع العلامات المخصصة استراتيجيات للحصول على المعلومات الأكثر إلحاحا من الجهاز من الفائدة. تستخدم موريسون وزملاؤه CldU وإيدو : 1 كل يوم لتسمية تكون الدم 2. كوهن وزملاؤه استخدام CldU وإيدو لمدة 4 أيام للكشف عن كل انقسام الخلايا في عضلة القلب تجديد 3. في المقابل ، فقد استخدمنا CldU وإيدو لمدة تصل إلى 9 أشهر لتسمية القاعدية إجمالي قيمة التداول داخل الخلية جزيرات البنكرياس ، والأنسجة مع دوران الخلية والحد الأدنى للأعمار الحيوانات 1،4-6. التطبيق الأكثر وضوحا المحتملة لوضع العلامات لدينا استراتيجية لدراسات لتحديد معدل دوران خلية ضمن توازن الأنسجة. ولكن لدينا التقنية لديها العديد من التطبيقات الأخرى المحتملة. على سبيل المثال ، فإننا أيضا تطبيق هذه التقنية في الآونة الأخيرة لتحديد التحول أنكجنيك داخل أنسجة ، حيث يمكن تكراره في مجالات التركيز زيادة التعرف بسهولة من قبل التأسيس أو زيادة CldU إيدو 5. تستخدم موريسون وزملاؤه CldU وإيدو : 1 كل يوم لاختبار سلوك الاحتفاظ التسمية من الخلايا الجذعية المكونة للدم 2. لقد طبقنا أيضا وضع العلامات التماثلية ثيميدين متتابعة لتحديد ما إذا كان العبور تضخيم الخلايا تساهم في النمو أو تجديد الأنسجة 1. في هذه الادارة تطبيق متتابعة من نظائرها ثيميدين يمثل نهجا جديدا لدراسة أصول وبقاء الخلايا المشاركة في توازن الأنسجة.
لا ينبغي أن تستخدم نظائرها ثيميدين دون الحذر. نظائرها ثيميدين الاصطناعية والسميات المحتملة لتقسيم الخلايا ، واستخدامها من الناحية النظرية يمكن أن تؤثر في الحيوانات دوران الخلية المتنامية. وقد استخدمت ونظائرها ثيميدين radiosensitizing كلاء لمرضى السرطان ، وبطء دوران قد الخلية. وبالتالي فإننا نحث المحققين للتحقيق بحذر عن السميات المحتملة في الأنسجة اهتمامهم. على سبيل المثال ، Trumpp والزملاء وجدت أن BrdU الجهازية يمكن أن تجبر الخلايا الجذعية المكونة للدم لدخول دورة الخلية 7. على سبيل المثال ، لاحظ روتر وزملاؤه أن ارتفاع نظائرها ثيميدين جرعة سامة لتطوير البنكرياس 8. في الآونة الأخيرة هيلرشتاين وزملاؤه في KineMed ، وجدت أن شركة BrdU الادارة تبطئ داخل جزيرة الانتشار 16-25 ٪ باستخدام ملكية العلامات تقنية المياه الثقيلة 9. تضمنت استعدادات الجزيرة كلها التي يستخدمها هيلرشتاين وزملاؤه الغدد الصماء وغيرها من أنواع الخلايا غير الغدد الصماء ، والتي قد تشمل ما يصل الى 50 ٪ من مجموع الاستعدادات جزيرة. ومع ذلك ، نجد أن التسريب المطول للBrdU لا تؤثر على تكاثر الخلايا بيتا في الفئران البالغين الشباب ، كما تقاس ki67 التعبير 4. وبالمثل ، على المدى الطويل وإدارة CldU إيدو لا يبدو أن يضعف بيتا التوسع الشامل الخلية 1. وعلاوة على ذلك ، بيتا معدلات تكاثر الخلايا وتعادل بين الفئران في المسمى مع BrdU لفترات طويلة من الزمن والفئران التي وصفت فقط لبضع ساعات (تم تطبيع أسعار الفائدة لفترات زمنية ما يعادلها). معا ، وهذه النتائج تشير إلى أن الفئران يمكن أن يتسامح مع بأمان على المدى الطويل جرعة منخفضة من إدارة ثيميدين نظائرها. لا يزال ، لا يمكننا أن نستبعد السمية المحتملة من قبل نظائرها ثيميدين بيتا في البنكرياس في نمو الخلايا. نتيجة لذلك ، نواصل تنفيذ الضوابط عندما وسم الفئران مع نظائرها ثيميدين ، ونحث محققين آخرين على القيام بذلك أيضا.
لدينا أسلوب متسلسل ثيميدين العلامات التماثلية لا يخلو من العثرات والتحديات التقنية. ونتيجة لذلك ، والشرائح السيطرة ذات أهمية خاصة. لقد ولدت لنا السيطرة الشرائح التي تتكون من أنسجة مختلفة من 1) الفئران التي وصفت فقط مع CldU ؛. 2) الفئران التي وصفت فقط مع إيدو ؛ 3) الفئران التي وصفت بالتتابع مع CldU ثم تعاطي المخدرات بالحقن ؛ 4) الفئران التي وصفت بالتسلسل في ترتيب عكسي ، أولا مع إيدو وCldU ثم ؛ 5) الفئران التي هي وهمية المسمى مع الماء فقط. عندما تعلم أن التسمية مع CldU وإيدو ، وينبغي للمحققين يحمل دائما خارج البروتوكول كامل مع جميع مجموعات من الشرائح 5 أعلاه من الأنسجة من الاهتمام.
عبر التفاعل في ما بين طفيفة وCldU إيدو هو مؤسف لكن لا مفر منه الجانب السلبي لوضع العلامات على حد سواء مع نظائرها ثيميدين. وتستند هذه التقنية على إيدو CldU والاختلافات في الانتماءات في ما بين أمصال مضادة التي كانت مستمدة في الأصل ضد BrdU في الأنواع المختلفة (الفأر والفئران). بروتوكول لدينا ، في حين مرهقة ، يهدف الى تقليل التفاعل عبر هذا القبيل. وبالتالي ، فإننا نحث الحذر في أوساط المحققين الذين يعتبرون تخطي الخطوة (ق) من البروتوكول. على وجه الخصوص ، لديناواجه مشاكل مع أمصال مضادة الثانوية التي يتم التفاعل المتبادل في ما بين الفأر والفئران. يمكن التقليل من ذلك عن طريق استخدام الأمصال الضدية جاكسون التي يتم بالكامل عبر كثف في ما بين الفأر والفئران.
فشلنا في بعض الأحيان بشكل كاف للكشف عن دمج ثيميدين. في مثل هذه الحالات من المهم جدا لاستخدام الشرائح مراقبة إيجابية لتحديد أي خطوة أو كاشف لم يكن يعمل. الصعوبات التي عادة ما تكون بسبب سوء aliquots أمصال مضادة ، والشرائح الجاف ، أو permeabilization النووية غير كافية. لقد فشلنا في تسمية بنجاح الأجنة النامية مع إيدو. وبالتالي ، قد لا تكون قابلة للاختراق جميع الأنسجة لإيدو.
بدائل لCldU وإيدو لمضاعفة العلامات التماثلية ثيميدين تلوح في الأفق. يمكن ايدو (5 - استراديول deoxyuridine - 2) تكون ركيزة لحفز النحاس فوق الكشف الكيمياء 10،11. طرق الكشف ايدو لا تتطلب الفصل بين حمض النووي ، وبالتالي فهي قابلة للغاية لتحليل التدفق الخلوي بنسبة 12. EDU متوافق ولكن ليس عبر التفاعل مع BrdU 10. وقد استخدمت لقياس دوران ايدو الخلايا والأنسجة المختلفة بما في ذلك الماوس خلايا بيتا في البنكرياس 13 ، L الخلايا المعوية 14 و 15 البشرة. ايدو هي مكلفة نوعا ما في لحظة (1000 دولار امريكى لكل 500mg). لا تزال وايدو ويبدو أن الكشف عن أكثر حساسية من الكشف BrdU 10. وبالتالي ، قد يكون من المجدي اقتصاديا للجمع بين ايدو وBrdU بدلا من CldU وإيدو. هذا الأسلوب قد تسمح أيضا للكشف عن ثلاث جولات مختلفة من انقسام الخلايا في الفئران لثلاثة أسباب تسمية ايدو ، CldU ، وتعاطي المخدرات بالحقن.
باختصار ، لدينا أسلوب متسلسل ثيميدين العلامات التماثلية هو نهج جديد للكشف عن دوران الخلية. نأمل نهجنا تمكن علماء آخرون على نحو أكثر دقة تحديد انقسام الخلايا ، ونتوقع أن تفتح نماذج جديدة في توازن الأنسجة.
Disclosures
أجريت جميع التجارب على الفئران في منشأة الحيوان في مستشفى الاطفال في فيلادلفيا وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC).
Acknowledgments
بدعم من JDRF ، المعاهد الوطنية للصحة (R01 - DK081469) ، ورابطة ولاية بنسلفانيا (مركز للتميز في الطب التجديدي منح 4100043362) ، ومارس من الدايمات (باسل أوكونور الباحث العلمي من بحوث جائزة كاتب) ، وجامعة ولاية بنسلفانيا التجريبية DERC ومنح جدوى (DK19525).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 0210547891 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedicals | 0210035701 | |
| 4% Paraformaldehyde | USB Corp., Affymetrix | 19943 | |
| 10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| XYLENES | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Hydrochloric Acid | VWR international | BDH3028-2.5LG | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Mouse Anti BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical & Scientific Corporation | OBT0030 | |
| Cy2 donkey anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). |
| Cy5 donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | See above |
| Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | |
| YFP Filter | Chroma Technology Corp. | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel |
| Cy3 Filter | Chroma Technology Corp. | 49004 ET Cy3 | |
| Cy5 Filter | Chroma Technology Corp. | 49006 ET Cy5 | |
| ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu Corp. | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |
References
- Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).
- Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).
- Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
- Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. , (2009).
- He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. , (2009).
- Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).
- Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).
- Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).
- Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).
- Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).
- Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).
- Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).
- Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).
- Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).
- Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).
- Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).
