Summary
Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos para cuantificar dos rondas sucesivas de la división celular. Esta estrategia es útil para detectar la renovación celular de larga duración, los tejidos, la transformación oncogénica, o células de amplificación de tránsito.
Abstract
La medición precisa de la división celular es un reto fundamental en la biología experimental que se convierte cada vez más complejo cuando poco a poco las células en división son analizados. Métodos establecidos para detectar la división celular incluyen la visualización directa por microscopía de continuo en cultivo celular, la dilución de colorantes vitales como carboxifluoresceína éster di-aetate succinimidilo (CFSE), inmuno-detección de antígenos mitogénica como ki67 y PCNA, y los análogos de la timidina. Análogos de la timidina puede ser detectada por una variedad de métodos como la radio de detección de timidina tritiada, inmuno-detección de bromo-desoxiuridina (BrdU), cloro-desoxiuridina (CldU) y yodo-desoxiuridina (UDI), y la detección química de etinil-desoxiuridina (EDU). Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los diferentes análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos. Nuestro método permite a los investigadores para cuantificar con precisión dos rondas sucesivas de la división celular. Mediante la optimización de los protocolos de tinción nuestro enfoque puede detectar los análogos de la timidina dosis muy baja administra con el agua potable, segura de administrar a los ratones durante períodos prolongados de tiempo. Por lo tanto, nuestra técnica puede ser utilizada para detectar la renovación de células en los tejidos de muy larga duración. Óptimos resultados de la tinción immunofluoresent se puede lograr en múltiples tipos de tejidos, incluyendo el páncreas, piel, intestino, hígado, suprarrenales, testículos, ovarios, tiroides, ganglios linfáticos y el cerebro. También hemos aplicado esta técnica para identificar la transformación oncogénica en los tejidos. Además, hemos aplicado esta técnica para determinar si la amplificación de tránsito de las células contribuyen al crecimiento o la renovación de los tejidos. En este sentido, la administración secuencial de los análogos de la timidina representa un nuevo enfoque para el estudio de los orígenes y la supervivencia de las células que participan en la homeostasis del tejido.
Protocol
1. Los tejidos etiquetado con CldU y UDI
- Disolver análogos de la timidina (CldU o UDI) en el agua. Pesar ml 1 mg / de cada producto químico y añadir a separar las botellas de vidrio de agua destilada. Por lo general preparar 1 litro de cada uno a la vez.
- Disolver los productos químicos en una placa de agitación o de otro tipo de agitador. CldU se disuelve en 10 min. de agitación a temperatura ambiente. UDI exige más de una hora de agitación a 37 ° C en un agitador. Las fuentes de agua puede influir en la solubilidad UDI. Si UDI sigue sin suspensión después de la noche temblando, trata de una fuente limpia de agua. Las soluciones se almacenan a 4 ° C en la oscuridad.
- Administrar la solución que contiene timidina primero (ya sea CldU o UDI) a los ratones durante el periodo de etiquetado deseado. No permita que los ratones para que tuvieran acceso al agua sin etiqueta durante el período de etiqueta. Cuando el período de etiquetado designado se ha completado, comienza un periodo de lavado con agua sin etiqueta por lo menos 24 horas (los análogos de la timidina que contiene suero tienen una vida media de varias horas). Administrar la solución que contiene timidina segunda (ya sea CldU o UDI) a los ratones durante el periodo de etiquetado deseado. Botellas de relleno de agua con regularidad para evitar la deshidratación!
- Por otra parte, los ratones pueden ser etiquetados por la inyección intraperitoneal de CdlU secuencial y UDI. Prepare CldU o CDI en 10 mg / ml de concentración. UDI puede requerir gota a gota, además de la solución concentrada de hidróxido sódico seguido de una agitación vigorosa para entrar en suspensión. No agregue exceso de hidróxido sódico. Añadir una gota de hidróxido de sodio a una solución de 10 ml de UDI seguido por una hora de agitación a 37 ° C en un agitador. Si no es así en la solución, repetir la adición de hidróxido de sodio. Inyectar 100 mcg por g de peso corporal en el espacio intraperitoneal.
- Portaobjetos de control son esenciales para este protocolo. Como resultado de ello, le recomendamos los investigadores llevar a cabo diversas variaciones de etiquetado análogo de la timidina para asegurar la sensibilidad y especificidad. Estas deben incluir: 1. Los ratones que fueron etiquetados sólo con CldU, 2. Los ratones que fueron etiquetados sólo con CDI, 3. Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial con CldU UDI y luego 4. Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial en orden inverso, primero con el IDU y CldU entonces, cinco ratones a los que se burlan etiquetados con agua solamente. Cuando se aprende a la etiqueta con CldU y UDI, los investigadores siempre deben llevar a cabo todo el protocolo con los 5 juegos por encima de los portaobjetos de control de los tejidos de interés.
2. Cosecha de tejidos, fijación, y preparación de los portaobjetos
- Utilizando el anestésico apropiado, lleve a cabo una sobredosis letal y sacrificio del ratón a través de desangrado. Eliminar el tejido fresco y arreglar con un 4% paraformalehyde a 4 ° C durante 24 horas. La transferencia de tejido para amortiguar 01:04 formalina y se almacenan a 4 ° C para la incrustación.
- Por otra parte, realizar sobredosis letal y perfundir el ratón a través del ventrículo izquierdo cardíaco con solución salina hasta que la sangre se elimina del cuerpo, inmediatamente después perfundir con 30-50 cc de paraformaldehído al 4%. Eliminar los tejidos de interés y almacenar en búfer 01:04 formol a 4 ° C para la incrustación.
- Después de la deshidratación del tejido y la inclusión en parafina, corte de 5 micras secciones de tejido y el lugar en portaobjetos de cargos. Hornear las láminas a 65 ° C durante 16 horas para asegurar la adhesión del tejido a la diapositiva (esencial con medidas de recuperación de antígeno más adelante).
3. La deshidratación, la permeabilización, y Antigen recuperación
- Retire el exceso de parafina por inmersión de diapositivas en dos baños de xileno durante 5 min. cada uno.
- Rehidratar el tejido mediante la inmersión de diapositivas en etanol diluido en agua: 100, 95, 90, 80 70 y el 50%. Sumerja los portaobjetos durante 3 minutos. en cada concentración, a partir de 100% y va hasta un 50% de la inmersión final.
- Lavar los portaobjetos durante 5 minutos. en 1x PBS.
- Permeabilizar las células mediante la inmersión de las diapositivas en Triton X-solución al 0,2% durante 5 minutos (recién hecho cada vez).
- Preparar diapositivas para la recuperación de antígenos del tejido microondas. Colocar los portaobjetos en un vaso de vidrio con un volumen suficiente 0,01 M pH 6,0 tampón de citrato de sodio, por lo que la solución cubre 5 cm por encima de la parte superior de las diapositivas para dar cuenta de la pérdida por evaporación.
- Diapositivas de microondas hasta que la solución está en ebullición (3-10 min. A plena potencia). Reducir la potencia hasta que la solución es hervir lentamente (10-80%) y continuar por otros 20 min. Compruebe microondas periódicamente para asegurar la solución se mantiene a fuego lento.
- Vaso lugar con diapositivas en un banco-superior y deje que se enfríe ligeramente a temperatura ambiente, (aproximadamente 2 horas).
- Confirmar que se desliza están a temperatura ambiente usando un termómetro.
- Sumerja los portaobjetos en 1.5N HCL durante 40 minutos. a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos dos veces en 1X PBS, 5 min. por lavado.
4. Anticuerpos primarios y secundarios
- Es importante que las diapositivas se mantienen muy húmedos a través de todo el protocolo. Tejido seco se han auto mucho másFluorescencia, por lo que las imágenes resultantes inutilizable. Para prevenir la muerte, el proceso de una diapositiva a la vez.
- Círculo de cada sección en las diapositivas con un líquido de bloqueo (es decir, cera) pen. Colocar los portaobjetos en el recipiente de 1x PBS.
- Haga una cámara de incubación húmeda mediante la colocación de toallas de papel mojadas colocadas en el fondo de un recipiente de plástico hermético.
- Constituyen la solución de bloqueo de suero burro 10% diluido en PBS 1x. Es importante para cubrir completamente cada sección con la solución. Para las secciones de tejidos que son 1 x 1,5 cm, un volumen de 50 micro-litros de solución por cada sección es suficiente.
- Añadir la solución de bloqueo a las diapositivas. Eliminar diapositivas de 1x PBS y eliminar el exceso de líquido golpeando suavemente el borde de diapositivas en una pila de toallas de papel seca. Lugar de diapositivas en la cámara de incubación y añadir 50 micro-litros de solución de bloqueo del 10% de cada sección. Cuando todas las diapositivas se han completado cerca del recipiente y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Preparar la dilución del anticuerpo primario para detectar UDI. Diluir el ratón anti-BrdU a una concentración de 1:250 en burro 5% de suero hecho en 1x PBS. Elimine el bloque de solución de diapositivas y vuelva a colocar en la cámara de incubación. Añadir el anticuerpo primario por encima de cada sección y se incuba durante la noche a 4 ° C.
- Prepare lavado de alto rigor (que reduce al mínimo vinculante de ratón anti-BrdU antisueros CldU). Maquillaje fresco tampón de baja TBST sal (36 mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). Que se necesitan 40 ml de solución tampón por par de guías. Añadir 40 ml de buffer a cada tubo cónico de 50 ml. Antes de agregar diapositivas, precalentar la solución a 37 ° C.
- Dos a la vez, eliminar las diapositivas de la cámara de incubación, el lugar de nuevo hacia atrás (para que las muestras de tejido cara lejos el uno del otro) y el grifo principal anticuerpo en exceso. Colocar los portaobjetos en los tubos llenos de TBST baja en sal y la tapa. Agitar los tubos durante 20 minutos. en un temblor de cultivo bacteriano incubadora con la temperatura a 37 ° C, y la velocidad ajustada a 225 rpm.
- Este lavado dos veces en PBS 1X. 5 min. por lavado.
- Prepare la siguiente solución primaria de anticuerpos para la detección de antígeno tisular CldU y, si lo desea. Diluir rata anti-BrdU a una concentración 1:250 en burro 5% de suero hecho en 1x PBS. Diluir antisueros primaria contra el antígeno del tejido en el trabajo de concentración en la solución de anticuerpo primario.
- Toque en el exceso de PBS 1x fuera de las diapositivas, y colocarlos en la cámara de incubación. Añadir el anticuerpo primario a cada sección y se incuba durante la noche a 4 ° C.
- Este lavado dos veces en PBS 1X. 5 min. por lavado.
- Prepare la solución de anticuerpo secundario. Diluir Cy2 burro anti-rata a 1:250 y Cy5 burro anti-ratón de 1:500 en una solución 1X PBS que contenía 5% de suero de burro. Añadir Cy3 secundaria para detectar las principales especies de antisueros tejido antígeno. Además, diluir una solución madre 0,4 mg / ml de DAPI a 1:150 en una solución de anticuerpo secundario.
- Toque en el exceso de PBS 1X y se desliza a cabo en la cámara de incubación. Añadir la solución de anticuerpo secundario para cada sección y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Este lavado dos veces en PBS 1X. 5 min. por lavado.
- Toque en el exceso de PBS 1X fuera de las diapositivas y se adhieren con cubierta de vidrio prolongar Oro anti-fade medios de montaje (NO use Vectashield con tintes dyanine!). Pulse sobre cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire. Almacenar a 4 ° C.
5. Imágenes y análisis
- La imagen del tejido de interés con un microscopio de fluorescencia equipado con una fuente de energía de la luz alta, apocromático plan de los objetivos, y una cámara de microscopio de alta eficiencia (por ejemplo, Hamamatsu Orca ER). Captura de imágenes en la AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antígeno tisular), y Cy5 canales (UDI). Combinar imágenes para crear un único multi-capa de archivo de imagen.
- Si se realiza correctamente, los núcleos teñidos DAPI será homogénea brillante. Antígenos del tejido (por ejemplo, insulina) deben revelar las células de interés. Si la tinción con DAPI o tejido de antígeno es débil o inconsistente, deslice sumergirse en 1X PBS durante la noche para quitar la tapa deslizante y repetir la aplicación de antisueros secundaria.
- Centrarse en el antígeno en el tejido Cy3. Compruebe CldU y manchas en la UDI Cy2 y Cy5 canales, cambiar entre canales. Buscar la posible reactividad cruzada entre los marcadores, como se indica por el exceso de UDI y CldU co-positividad. Busque los tejidos que contienen sólo CldU o UDI. La falta de núcleos CldU o UDI positivo puede indicar un problema técnico con el etiquetado o las manchas. En este caso, busque un tejido altamente replicativa (por ejemplo, nodo linfático).
- Analizar las imágenes. Mostrar las capas que contienen el antígeno DAPI y tejidos. El uso de un marcador de pizarra blanca en la mano dominante y un contador de células en la mano no dominante, marque cada núcleo con una marca de contraste con un marcador de borrado en seco (también conocido como blanco marcador de la placa). Recuento de células DAPI positiva en el tejido de interés. Registro total de células. Use una goma de borrar en seco para eliminar las marcas. Visualización de capass DAPI, antígeno tisular, y CldU. Recuento de células CldU positiva dentro del tejido de interés. Registro CldU recuento de células, pero no borrar las marcas. Cambiar la pantalla para visualizar las capas de tejido que contiene el antígeno, CldU y UDI. Conde CldU UDI células positivas doble. Valor de grabar, borrar todas las marcas, y mostrar capas con DAPI, antígeno tisular, y UDI. Cuente el número total de células positivas UDI en el tejido de interés. Registro UDI recuento de células.
6. Resultados representante
Hemos marcado secuencial 6 semanas de edad ratones hembra con CldU durante una semana y luego UDI durante dos semanas, seguido por el sacrificio inmediato. Páncreas se tiñeron para detectar CldU, UDI, y la insulina (un antígeno tisular), así como DAPI. Islotes se tiñeron de manera uniforme con la insulina. CldU núcleos teñidos eran distintos de los núcleos teñidos UDI (Figura 2). Muchos núcleos fuera de la isleta se CldU UDI co-positivos (Figura 2, abajo a la derecha, flechas blancas). Una célula de la insulina positivo solo había tinción nuclear, tanto para CldU y UDI (Figura 2, abajo a la derecha, flecha magenta).
Ratones. Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo a las directrices del Comité de IACUC del Hospital de Niños de Filadelfia. Mujer B6.129 F1 ratones de tipo salvaje fueron adquiridos de Taconic (Germantown Nueva York), con sede en las instalaciones de animales de laboratorio en el Hospital de Niños de Filadelfia, y se alimenta del ratón Dieta de 5015 PMI Nutrición Internacional (Richmond. Indiana).
Etiquetado de la estrategia. Mediante el etiquetado, el caso de la división celular, primero con CldU (marcado en verde en este esquema) y la segunda división celular con la UDI (marcado en rojo en este esquema), secuencial los resultados de la división celular en las células co-marcado con ambas CldU y UDI (verde / rojo) .
Los resultados representativos de la timidina etiquetado de la facturación de células pancreáticas en ratones. La imagen de inmunofluorescencia de un páncreas de un ratón con los islotes de Langerhans en el centro. Ratón fue infundido con CldU durante 1 semana y luego UDI por 2 semanas en el agua potable antes de su sacrificio inmediato. Muestra de páncreas se ha procesado como se describe en el protocolo. 40x imágenes objetivas, con distintas capas se muestra adecuado para el conteo. Imágenes fusionadas contienen DAPI (blanco) CldU (verde), UDI (rojo), insulina (amarillo). (Superior izquierda) DAPI y la insulina. (Superior derecha) CldU y la insulina. (Inferior izquierda) IDU y la insulina. (Inferior derecha) CldU, UDI, y la insulina. Barra de escala: 100μm.
Figura 1. Estrategia de etiquetado. Mediante el etiquetado, el caso de la división celular, primero con CldU (marcado en verde en este esquema) y la segunda división celular con la UDI (marcado en rojo en este esquema), secuencial los resultados de la división celular en las células co-marcado con ambas CldU y UDI (verde / rojo) .
Figura 2. Los resultados representativos de la timidina etiquetado de la facturación de células pancreáticas en ratones. La imagen de inmunofluorescencia de un páncreas de un ratón con los islotes de Langerhans en el centro. Ratón fue infundido con CldU durante 1 semana y luego UDI por 2 semanas en el agua potable antes de su sacrificio inmediato. Muestra de páncreas se ha procesado como se describe en el protocolo. 40x imágenes objetivas, con distintas capas se muestra adecuado para el conteo. Imágenes fusionadas contienen DAPI (blanco) CldU (verde), UDI (rojo), insulina (amarillo). (Superior izquierda) DAPI y la insulina. (Superior derecha) CldU y la insulina. (Inferior izquierda) IDU y la insulina. (Inferior derecha) CldU, UDI, y la insulina. Barra de escala: 100μm.
Discussion
Nuestro enfoque de la timidina enfoque basado en el etiquetado la renovación celular tiene muchas aplicaciones potenciales en la investigación biomédica. Hasta la fecha, nos hemos concentrado en el páncreas, pero también hemos aplicado esta estrategia para examinar la renovación celular de la piel, intestino, hígado, riñón suprarrenal, testículos, ovarios, tiroides, ganglios linfáticos, la hematopoyesis, y el cerebro 1. Debido a la renovación celular varía de un tejido a otro, las estrategias de etiquetado debe ser personalizado para obtener la información más convincente desde el órgano de interés. Morrison y sus colegas utilizaron CldU UDI y de un día para cada etiqueta de la hematopoyesis 2. Kuhn y sus colegas utilizan CldU UDI y durante 4 días cada uno para detectar la división celular en la regeneración del miocardio 3. Por el contrario, hemos utilizado CldU UDI y de hasta 9 meses en total para etiquetar el volumen de negocios de células basales en los islotes pancreáticos, un tejido con una facturación mínima de células como las edades de los animales 1,4-6. La posible aplicación más evidente de nuestra estrategia de etiquetado para los estudios para definir la renovación celular en la homeostasis del tejido. Sin embargo, nuestra técnica tiene varias aplicaciones potenciales. Por ejemplo, recientemente aplicado esta técnica para identificar la transformación oncogénica en los tejidos, donde las áreas focales de aumento de la replicación puede ser fácilmente identificado por una mayor incorporación de CldU o CDI 5. Morrison y sus colegas utilizaron CldU UDI y de un día cada uno para determinar el comportamiento de la etiqueta de retención de las células madre hematopoyéticas 2. También hemos aplicado el etiquetado secuencial análogo de la timidina para determinar si la amplificación de tránsito de las células contribuyen al crecimiento o la renovación de los tejidos 1. En esta administración la aplicación secuencial de los análogos de la timidina representa un nuevo enfoque para el estudio de los orígenes y la supervivencia de las células que participan en la homeostasis del tejido.
Análogos de la timidina no debe utilizarse con prudencia. Análogos sintéticos timidina tienen efectos secundarios potenciales de las células en división, y su uso en teoría podría poner en peligro la renovación de células de animales en crecimiento. Análogos de la timidina se han utilizado como agentes radiosensibilizadores para pacientes con cáncer, y puede retrasar la renovación celular. Por ello, instamos a los investigadores a investigar con cautela por la toxicidad potencial en el tejido de interés. Por ejemplo, Trumpp y sus colegas encuentran que sistémica BrdU puede obligar a las células madre hematopoyéticas para entrar en el ciclo celular 7. Por ejemplo, Rutter y sus colegas observaron que las altas dosis de análogos de la timidina son tóxicos para el desarrollo de páncreas 8. Más recientemente Hellerstein y sus colegas de KineMed, Inc. encontró que BrdU administración retrasa la proliferación intra-islote de 16 a 25% utilizando una técnica patentada pesados etiquetado del agua 9. Los preparativos islote todo utilizado por Hellerstein y sus colegas contenidos endocrinos y muchas otras no endocrinos tipos de células, que puede incluir hasta un 50% de las preparaciones de islotes total. Sin embargo, nos encontramos con que la infusión prolongada de BrdU no influye en la proliferación de células beta en ratones adultos jóvenes, según lo medido por la expresión de ki67 4. Del mismo modo, la administración prolongada de CldU y UDI no parece afectar a la expansión masa de células beta 1. Por otra parte, la proliferación de células beta tasas son equivalentes entre los ratones etiquetado con BrdU durante largos períodos de tiempo y de los ratones que sólo están marcados por unas cuantas horas (las tasas se normalizan a períodos de tiempo equivalente). En conjunto, estos resultados sugieren que los ratones puede tolerar con seguridad a largo plazo bajo la administración de dosis de los análogos de la timidina. Sin embargo, no podemos descartar la posible toxicidad de los análogos de la timidina en el crecimiento de las células beta del páncreas. Como resultado, se continúan realizando los controles de etiquetado cuando los ratones con análogos de la timidina, e instamos a otros investigadores a hacer lo mismo.
Nuestra técnica de etiquetado secuencial análogo de la timidina no está exenta de dificultades y desafíos técnicos. Como resultado, los portaobjetos de control son especialmente importantes. Hemos generado un portaobjetos de control que consisten en varios tejidos de 1) Los ratones que fueron etiquetados sólo con CldU;.. 2) Los ratones que fueron etiquetados sólo con CDI;. 3) Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial con CldU y UDI;. 4) Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial en orden inverso, primero con el IDU y CldU entonces;. 5) Los ratones que son simulacros de la etiqueta sólo con agua. Cuando se aprende a la etiqueta con CldU y UDI, los investigadores siempre deben llevar a cabo todo el protocolo con los 5 juegos por encima de las diapositivas de los tejidos de interés.
Reactividad cruzada entre leve y CldU UDI es un inconveniente lamentable pero inevitable para el etiquetado de los análogos de la timidina. La técnica CldU y UDI se basa en diferencias en las afinidades entre los antisueros que se derivaron originalmente contra BrdU en diferentes especies (ratón y rata). Nuestro protocolo, mientras que engorroso, está diseñado para minimizar la reactividad cruzada tales. En consecuencia, instamos cautela entre los investigadores que consideran que saltarse el paso (s) del protocolo. En particular, hemostenido problemas con antisueros secundarios que son de reacción cruzada entre el ratón y la rata. Esto puede ser minimizado por el uso de antisueros Jackson que están totalmente absorbidos por el cross-entre el ratón y la rata.
De vez en cuando no detecta adecuadamente la incorporación de timidina. En estos casos es muy importante utilizar láminas positivas de control para determinar que los reactivos o el paso no estaba funcionando. Las dificultades son por lo general debido a la mala alícuotas de sueros, se desliza en seco, o permeabilización nuclear inadecuada. Hemos fracasado en la etiqueta con éxito el desarrollo de los embriones con UDI. Por lo tanto, no todos los tejidos pueden ser permeables a la UDI.
Alternativas a la CldU y UDI de doble etiquetado análogo de la timidina en el horizonte. Edu (5-etinil-2 desoxiuridina) puede ser un sustrato para la detección de cobre química catalizada haga clic en 10,11. Métodos de detección de Edu no requieren la separación de las hebras de ADN, por lo que son altamente susceptibles de análisis por citometría de flujo 12. Edu es compatible, pero no de reacción cruzada con BrdU 10. Edu se ha utilizado para cuantificar el recambio celular de los tejidos del ratón, asimismo, de las células beta pancreáticas 13, L 14 células intestinales y de la epidermis 15. Edu es bastante caro en el momento ($ 1000 EE.UU. por 500 mg). Sin embargo, la detección de Edu parece ser mucho más sensible que la detección de BrdU 10. Por lo tanto, podría ser económicamente viable para combinar Edu y BrdU en lugar de CldU y UDI. Este método también podría permitir la detección de tres rondas de división celular en ratones triplemente etiquetados para Edu, CldU y UDI.
En resumen, la técnica de etiquetado secuencial análogo de la timidina es un enfoque novedoso para la detección de la renovación celular. Esperamos que nuestro enfoque permite a otros científicos para cuantificar con mayor precisión la división celular, y esperamos que se abran nuevos paradigmas en la homeostasis del tejido.
Disclosures
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo en las instalaciones de animales en el Hospital de Niños de Filadelfia, de acuerdo con las directrices del Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC).
Acknowledgments
El apoyo de la JDRF, el NIH (R01-DK081469), el Estado de Pennsylvania (Centro de Excelencia en Medicina Regenerativa de concesión 4100043362), March of Dimes (Basil O'Connor arranque Premio de Investigación Académico) y la Universidad de Pennsylvania piloto DERC y la viabilidad de subvención (DK19525).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 0210547891 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedicals | 0210035701 | |
| 4% Paraformaldehyde | USB Corp., Affymetrix | 19943 | |
| 10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| XYLENES | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Hydrochloric Acid | VWR international | BDH3028-2.5LG | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Mouse Anti BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical & Scientific Corporation | OBT0030 | |
| Cy2 donkey anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). |
| Cy5 donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | See above |
| Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | |
| YFP Filter | Chroma Technology Corp. | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel |
| Cy3 Filter | Chroma Technology Corp. | 49004 ET Cy3 | |
| Cy5 Filter | Chroma Technology Corp. | 49006 ET Cy5 | |
| ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu Corp. | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |
References
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