Summary
Аутоиммунные гипофизит могут быть воспроизведены у мышей путем введения экстракта мыши белки гипофиза.
Abstract
Аутоиммунные гипофизит является хроническое воспаление гипофиза причиной или сопровождаться аутоиммунных 1. Он традиционно считается редким заболеванием, но отчетность заметно возросла в последние годы. Гипофизит, по сути, развивается не редкость, как "побочный эффект" у онкологических пациентов, получавших антитела, которые блокируют рецепторы тормозных экспрессируется на Т-лимфоциты, таких как CTLA-4 2 и PD-1 рецепторов. Аутоиммунные гипофизит могут быть вызваны экспериментальным путем введения мышам с гипофизом белки смешать с адъювантной 3. В этом видео статье мы покажем, как извлекать белки из мыши гипофиза и как подготовить их в форму, пригодную для индуцирования аутоиммунных гипофизит в SJL мышей.
Protocol
Экспериментальный протокол
Первым шагом в этом протоколе исследования является сбор большого количества мыши желез гипофиза. Второй шаг заключается в гомогенизации желез подготовить белков экстракта. Третий шаг состоит в эмульсию этих белков с жирной смесью.
Шаг 1: Сбор и хранение мыши гипофиза
Мышь гипофиз находится у основания черепа в депрессию клиновидной кости называют турецкого седла, в окружении бокам тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов. Железа состоит из передней доли больших и меньших задней и промежуточной долях, и весит в среднем 1,9 мг. Гипофиза собираются от мышей смешанных штаммов, полов и возрастов, суждено быть умерщвлены с установкой, ухода за животными.
Для выделения гипофизом, мышь эвтаназии, кожу над черепом рассеченные, и кости черепа разрезать ножницами. Мозг поднимается подвергать гипофиза, который затем изолированы от окружающего твердой мозговой оболочки, зачерпнул из клиновидной кости и хранится в пластиковой трубки на сухом льду.
В целом мы используем 300 мышь гипофиза для одного белкового препарата, число, которое может быть собрана одним человеком в 9 часов.
После коллекции будет завершена, трубки, содержащей гипофиза хранится при температуре -80 ° С до готовности для следующего шага.
Шаг 2. Добыча мыши гипофиза белков
- Добавить гомогенизации буфер для 15-мл Сокол трубки (каталог не 352 059) держали в ледяной ванне, с помощью 250 мкл буфера на каждые 100 гипофиза собраны. Использование буфера ионной силы похож на тот, который является физиологически присутствующий в цитоплазме клетки (0,2 М) и физиологических рН (7,4). Мы используем фосфатным буферным раствором (0,161 М, рН 7,4), дополненные коктейль ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich, каталог не P8340-1мл).
- Добавить гипофиза в буфер перед гомогенизации, а затем поместить генератор (5-мм диаметр) Polytron гомогенизатор на дне пробирки Falcon. Однородный при максимальных оборотов в минуту в течение 30 секунд, плавно перемещая трубку Сокол вверх и вниз, держа его в ледяной ванне. Затем, отдых гомогената на льду в течение 1 мин. Повторите гомогенизации и охлаждения шаги еще два раза. Этот нежный гомогенизации должна сломаться клеток и высвобождение цитозольного белки, не нарушая ядер.
- Для удаления ядер, непрерывной ткани и нерастворимых материалов (например, соединительной ткани и денатурированные белковые комплексы), центрифуги гомогената на низкой скорости (1000 г) в течение 10 мин при 4 ° C.
- Передача супернатант (сейчас он называется пост-ядерном Супернатант, ПНС) в новую пробирку Falcon, заботясь, чтобы оставить нетронутой гранул, и хранить ПНС на льду.
- Ресуспендируют пеллет в первоначальный объем гомогенизации буфере (250 мкл буфера на каждые 100 гипофиза собраны), гомогенизации, как выше, центрифуги, как выше, а затем объединить второй ПНС с первой.
- Алиготе два объединения ПНС образцов в микроцентрифужных труб и хранить при температуре -80 ° С до готовности для следующего шага. Этот белковый препарат можно хранить при температуре -80 ° С, но постепенно теряет свою силу, поэтому мы рекомендуем использовать его в течение 6 месяцев с подготовки. Используйте небольшие аликвоты, чтобы определить выход белка и концентрации анализа BCA (Пирс каталога нет. 23225), и качество белка помощью гель-электрофореза. В общем, мы получаем около 60 мг белка от 300 гипофиза мыши в 1,5 мл буфера гомогенизации, при концентрации около 40 мг / мл.
Шаг 3. Подготовка эмульсии для иммунизации
- Оттепель быстро замороженные порции белка, необходимого для эксперимента и регулировать концентрации белка до 20 мг / мл. Этот белок экстракт будет эмульгированных 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA, Sigma F-5881), содержащий 5 мг / мл тепла убитых микобактерий туберкулеза (Becton Dickinson, 231141). Каждая мышь будет получать по 1 мг экстракта гипофиза в 100 мкл эмульсии.
- Пример, приведенный ниже, предназначена для иммунизации 10 мышей, где каждая мышь будет вводили 100 мкл эмульсии, содержащей 1 мг гипофиза белков. Разрешить два дополнительных мышей материальных потерь в период подготовки, так что используйте 12 мг гипофиза белков. Aspire 600 мкл 20 мг / мл гипофизарный экстракт белка описать выше, используя 2,5 мл Гамильтон газонепроницаемый шприц. Ресуспендируют CFA от сотрясения, и стремятся 600 мкл CFA в другой шприц 2,5 мл Гамильтон. Присоединение и безопасный 22 калибра микро-эмульгирующей иглу шприц с КФА. Медленно нажмите на поршень шприца КФА, что игла наполняется CFA, затем приложите и безопасной другой конециглы для шприц с экстрактом гипофиза.
- Медленно поршень шприца CFA толкать нефть компонента в acqueous гипофизарный экстракт, например, что только небольшое количество носит смешанный характер. Затем отодвинуть поршень шприца экстракта гипофиза в шприц КФА. Повторите это действие постепенно увеличивая количество материала, смешанный. Продолжайте, пока все содержимое два шприца носят смешанный характер. Вы получите беловатые и равномерно распределенное решение, которое представляет водно-нефтяной эмульсии.
- Как только образуется эмульсия, повторите возвратно-поступательное движение по меньшей мере 500 раз, чтобы гарантировать эмульсии тщательно перемешивают. После окончательного смешивания цикла, 1:01 водно-масляная эмульсия готова к использованию и содержит гипофиза концентрации белка 10 мг / мл. Эмульсии будут внесены в тот же день подкожно в анестезии SJL мышей, как указано в статье Юпитеру спутник.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на то что первый пациент с аутоиммунными гипофизит сообщалось, в 1962 году 4, патогенных гипофиза аутоантигенов еще предстоит идентифицировать 5. Экспериментальные модели на животных могут быть очень полезны в выявлении таких аутоантигенов, содействие открытию биомаркеров, которые переводимые в лечении пациентов. Эта статья продемонстрировала простой процедуры подготовки гипофиза белков в форме, адекватной для индуцирования аутоиммунных гипофизит у экспериментальных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант DK080351 к ПК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
