実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

Summary

自己免疫性下垂体炎は、マウス下垂体タンパク質の抽出物を注入することにより、マウスで再現することができる。

Abstract

自己免疫性下垂体炎は自己免疫¹によって引き起こされるかを伴う下垂体の慢性炎症です。それは伝統的に稀な疾患と考えられてきたが、レポートでは、近年著しく増加している。下垂体炎は、実際には、そのようなCTLA - 4 ²とPD - 1受容体としてTリンパ球上に発現する抑制性受容体をブロックする抗体を、治療を受けたがん患者の"副作用"として、稀にではない開発しています。自己免疫性下垂体炎はアジュバント³と混合下垂体タンパク質をマウスに注射することによって実験的に誘導することができる。このビデオの記事では、マウスの下垂体腺と方法SJLマウスにおける自己免疫性下垂体炎を誘発するのに適した形でそれらを準備してからタンパク質を抽出する方法を示します。

Protocol

実験的なプロトコル

この実験的なプロトコルの最初のステップは、マウスの下垂体腺の大きい数を集めることです。第二段階は、タンパク質の抽出液を調製するために腺を均質化するためです。第三段階は、油性混合物で、これらのタンパク質を乳化することです。

ステップ1：マウスの​​下垂体腺の収集と保管

マウス下垂体は視交叉によって三叉神経と前方で横方向に囲まれたトルコ鞍と呼ばれる蝶形骨、のうつ病における頭蓋底に位置しています。腺が大きく前葉と小さな後、中間葉で構成され、平均1.9ミリグラムの重されている。下垂体は、動物のケア施設で安楽死される運命、混合系統、性別、および年齢のマウスから収集されます。

下垂体を単離するために、マウスは、解剖頭蓋骨上記の皮膚を安楽死させ、頭蓋骨の骨は、はさみで開いてカットされます。脳は、その後、周囲の硬膜から分離された下垂体を、公開する持ち上げたちょう形骨の外スクープとドライアイス上にプラスチック製のチューブに格納されています。

一般的に我々は一つのタンパク質の準備、9時間で一人で収集することができる数は300、マウス下垂体腺を使用してください。

収集が完了すると、下垂体腺を含むチューブを-80℃で保存された·次のステップの準備ができるまでのC。

ステップ2。マウス下垂体タンパク質の抽出

1. 15 mlのファルコンチューブ（カタログ番号352059）に均質化緩衝液を追加すると、収集された100下垂体のためにバッファを250μlを用いて、氷浴中で保管。細胞の細胞質（0.2 M）の内側と生理的pH（7.4）の生理的に存在しているものと同様のイオン強度のバッファーを使用してください。我々は、リン酸塩を使用して緩衝生理食塩水（0.161 M、pH7.4）に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma - Aldrich社、カタログ番号P8340 - 1mLの）で補足。
2. ちょうど均質化する前にバッファに下垂体腺を追加し、その後、ファルコンチューブの一番下にポリトロンホモジナイザーの発電機（5 mmの直径）を置きます。氷浴中でそれを保ちながら優しく上下ファルコンチューブを移動させる、30秒間、最大rpmでホモジナイズする。その後、1分間氷上でホモジネートを置きます。均質化と冷却のステップをさらに2回繰り返します。この穏やかな均質化は、細胞を破壊し、核を中断することなく、細胞質タンパク質を解放する必要があります。
3. 核、切れ目のない組織と不溶性の物質を（そのような結合組織や変性タンパク質の複合体として）を削除するには、4℃で10分間、低速（千グラム）でホモジネートを遠心
4. 、新たなファルコンチューブに（今PNS、ポスト核上清と呼ばれる）上清を移すペレットはそのままにするように注意して、氷上でPNSを保存する。
5. 均質化緩衝液の元のボリューム（収集された100下垂体のためのバッファを250μL）でペレットを再懸濁し、上記のように均質化する、最初のもので2 PNSを結合して上記のように遠心分離、および。
6. -80℃で遠心チューブとストアへのアリコートをプールされたうちの2つのPNSサンプル° Cの次のステップの準備ができるまで。このタンパク質調製物を-80℃で保存できますCが徐々にその効力を失いますので、準備から6ヶ月以内にそれを使用することをお勧めします。ゲル電気泳動によってBCAアッセイ（Pierceのカタログがない。23225）、及びタンパク質の品質によってタンパク質の収量と濃度を決定するために小型のアリコートを使用してください。一般的に、我々は、40 mg / mLの周りの濃度で、均質化緩衝液を1.5mLで300マウスの下垂体からのタンパク質の約60 mgを得た。

ステップ3。予防接種のためのエマルションの調製

1. 急速に実験に必要な冷凍タンパク質のアリコートを解凍し、20 mg / mLのためにタンパク質の濃度を調整する。このタンパク質抽出物は、結核菌を（Becton Dickinson社、231141）殺された熱の5mg / mLを含む完全フロイントアジュバント（CFA、シグマF - 5881）と1:1で乳化されます。各マウスは、乳剤の100μLの下垂体抽出物1mgを受け取ります。
2. ここに示した例では、各マウスは下垂体タンパク質1mgを含有するエマルジョンを100μLを注入される10匹のマウスを、免疫するためです。準備中のマテリアルロスの2つの余分なマウスを許可するため、下垂体タンパク質の12 mgを使用してください。 20 mg / mlの下垂体タンパク質の抽出物のアスパイア600μLを2.5 mLのハミルトン気密注射器を使用して上記の説明。振とうしてCFAを再懸濁し、そして別の2.5mLのハミルトンシリンジにCFA 600μLを目指します。 CFAで満たされたシリンジに22ゲージのマイクロ乳化針を取り付け、固定します。ゆっくりと針がCFAで満たされているようなCFAの注射器のプランジャーを押し、その後のもう一方の端を接続し、確保する下垂体抽出液で満たされた注射器の針。
3. 徐々にのみ少量混合されていることなどacqueous下垂体抽出物、中に油成分をプッシュするCFAの注射器のプランジャーを進めます。その後、CFAの注射器に下垂体抽出物の注射器のプランジャーを押し戻す。徐々に混合材料の量を増加させるこの操作を繰り返します。 2つのシリンジの内容全体が混合されるまで続けます。あなたは、油中水滴型エマルションを表す白っぽいし、均等に分散されたソリューションが得られます。
4. エマルジョンが形成されると、エマルジョンが十分に混合されるように、少なくとも500回の往復運動を繰り返す。最終的なミキシングサイクルの後、1:1油中水型エマルジョンを使用する準備ができましたし、10 mg / mLの下垂体タンパク質濃度が含まれています。エマルジョンは、コンパニオンのjoveの記事で詳しく説明、皮下麻酔SJLマウスに同じ日に注入される。

Discussion

自己免疫性下垂体炎による最初の患者は1962年⁴に報告されているにもかかわらず、病原体抗原^5をまだ明らかにされないままである。動物モデルは、患者のケアに翻訳可能なバイオマーカーの発見を助ける、これらの自己抗原を識別するために非常に便利です。この記事では、実験動物における自己免疫性下垂体炎を誘発するための適切な形式で下垂体タンパク質を調製するための簡単​​な手順を実証してきました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay	Pierce, Thermo Scientific	23225
Complete Freund’s Adjuvant (CFA)	Sigma-Aldrich	F-5881
Mycobacterium tuberculosis	BD Biosciences	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle