Summary
Otoimmün hipofizitis fare hipofiz proteinlerin bir özü enjekte farelerde çoğaltılabilir.
Abstract
Otoimmün hipofizitis otoimmünite 1 neden olduğu ya da eşlik hipofiz bezinin kronik iltihabıdır. Geleneksel olarak, nadir görülen bir hastalık kabul edilmiştir, ancak raporlama son yıllarda önemli ölçüde arttı. Hipofizitis, aslında, T lenfositleri, CTLA-4 2 ve PD-1 reseptör olarak ifade inhibitör reseptörlerini bloke eden antikorlar ile tedavi edilen kanser hastalarında bir "yan etkisi" olarak seyrek değil geliştirir. Otoimmün hipofizitis bir adjuvan 3 ile karışık hipofiz proteinleri ile farelere enjekte edilerek deneysel olabilir. Bu video makalede fare hipofiz bezi ve nasıl SJL farelerde otoimmün hipofizitis inducing için uygun bir form hazırlamak için protein ayıklamak için nasıl göstermektedir.
Protocol
Deneysel Protokolü
Bu deney protokolünde ilk adım fare hipofiz bezi çok sayıda toplamak için. İkinci adım, bir protein elde etmek için bezleri homojenize. Üçüncü adım, yağlı bir karışım olan bu proteinler emülsifiye.
Adım 1: fare hipofiz bezi toplanması ve depolanması
Fare hipofiz bezi, optik kiazma trigeminal sinirler ve anteriora yanal çevrili sfenoid kemiğin sella tursika denilen bir depresyon, kafatasının dibinde oturur. Bezinin daha büyük bir ön lob ve küçük bir arka ve orta loblar oluşur ve ortalama 1.9 mg ağırlığında. Hipofiz bezlerin hayvan bakım tesisi tarafından ötenazi olmak kaderinde karışık suşlar, cinsiyet ve yaştan, farelerden alınan toplanır.
Hipofiz bezi izole etmek için, fare, disseke kafatası üzerinde cilt ötenazi ve kafatası kemiği makasla kesilerek açılır. Beyin, hipofiz bezi, daha sonra çevredeki duramater izole maruz kaldırdı sfenoid kemik scooped ve kuru buz üzerinde plastik bir tüp içinde depolanır.
Genel olarak bir protein hazırlık, 9 saat bir kişi tarafından toplanan çok sayıda fare 300 hipofiz bezleri kullanırlar.
Sonra, koleksiyon tamamlandığında, hipofiz bezleri içeren tüp sonraki adım için -80 ° C hazır olana kadar saklanır.
2. Adım. Fare hipofiz proteinleri çıkarımı
- 15 ml Falcon tüp (katalog 352.059) homojenizasyon tampon tampon 250 mcL toplanan her 100 hipofiz bezi kullanarak bir buz banyosunda tutulur. Hücre (0.2 M) ve fizyolojik pH (7.4) sitoplazma içinde fizyolojik olarak mevcut olan bir benzer iyonik güçlü bir tampon kullanın. Biz fosfat bir proteaz inhibitörü kokteyl (Sigma-Aldrich, katalog hiçbir P8340-1 ml) ile desteklenebilir (0,161 M, pH 7.4), tamponlu tuz kullanın.
- Homojenizasyon önce tampon hipofiz bezi ekleyin ve sonra Falcon tüpün dibinde Polytron homojenizatörlerinin jeneratör (5 mm çap) yerleştirin. Buz banyosu içinde tutarak hafifçe yukarı ve aşağı hareket Falcon tüp, 30 saniye boyunca maksimum rpm'de homojenize edilir. Daha sonra, 1 dakika boyunca buz üzerinde Homojenat bekletin. Homojenizasyon tekrarlayın ve soğutma iki kez daha adım. Bu nazik homojenizasyon, hücrelere zarar ve çekirdekleri aksatmadan sitozolik proteinler serbest bırakmak gerekir.
- Çekirdekleri, kesintisiz doku ve çözünmez malzemeleri (bağ dokusu ve denatüre protein kompleksleri gibi) çıkarmak için, 10 dakika 4 ° C düşük hızda (1000g) Homojenat santrifüj
- (PNS, Post-Nükleer Süzüntü olarak adlandırılır), yeni bir Falcon tüp süpernatantı transfer pelet rahatsız terk etmeye özen ve buz üzerinde PNS saklamak.
- Homojenizasyon tampon hacmi (toplanan her 100 hipofiz bezi için tampon 250 mcL) pelletini tekrar, yukarıdaki gibi homojenize yukarıdaki gibi santrifüj ve ilkinden sonra ikinci PNS birleştirmek.
- -80 Mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza kısım iki toplanmış PNS örnekleri ° C sonraki adım için hazır olana kadar. Bu protein, hazırlama, -80 saklanabilir ° C, ancak yavaş yavaş onun kudret kaybeder, bu nedenle hazırlık itibaren 6 ay içinde kullanmanızı öneririz. Jel elektroforezi ile protein verimi ve konsantrasyon BCA yöntemi ile (Pierce katalog no. 23225) ve protein kalitesini belirlemek için küçük bir kısım kullanın. Genel olarak, yaklaşık 40 mg / ml konsantrasyonda, 1.5 mL homojenizasyon tampon 300 fare pitüiter yaklaşık 60 mg protein almak.
Adım 3. Bağışıklama için emülsiyon hazırlanması
- Deney için gerekli donmuş protein alikotları hızla çözülme ve protein konsantrasyonu 20 mg / ml 'ye ayarlayabilirsiniz. Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141) öldürdü ısı 5 mg / ml içeren Komple Freund adjuvan (CFA, Sigma F-5881) Bu protein ekstresi 1:1 emülsiye olur. Her fare emülsiyon 100 mcL hipofiz ekstresi 1 mg alacaksınız.
- Burada verilen örnek, her bir fare 100 mcL 1 mg hipofiz proteinleri içeren emülsiyon ile enjekte edilecektir 10 fare, immunizing için. Hazırlanması sırasında maddi kaybı için iki ekstra farelerin izin ver, bu yüzden 12 mg hipofiz proteinlerin kullanın. 20 mg / ml hipofiz protein ekstresi Aspire 600 mcL 2.5 mL Hamilton gaz geçirmez şırınga kullanılarak yukarıdaki açıklar. Sallayarak CFA süspanse edin ve başka bir 2.5 mL Hamilton şırıngaya CFA 600 mcL talip. CFA dolu şırınga, 22 gauge bir mikro-emülgatör iğne takın ve güvenli. CFA iğne ile dolu olduğunu CFA şırınganın pistonu yavaşça itin, sonra diğer ucunu takın ve güvenlihipofiz ekstresi ile dolu şırınga, iğne.
- Yavaş yavaş yağ bileşeni sadece küçük bir miktar karışık olduğu gibi hem aköz hipofiz ekstresi, içine itmek için CFA şırınga pistonu ileri. Sonra CFA şırıngaya hipofiz ekstresi şırınganın pistonu geri itin. Karıştırılan malzeme miktarı yavaş yavaş artan bu işlemi tekrarlayın. Iki şırınga tüm içerik karışıncaya kadar devam edin. Su-yağ emülsiyonu temsil eden bir beyazımsı ve eşit bir çözüm elde edilecektir.
- Emülsiyon yapıldıktan sonra, emülsiyon iyice karıştırılır sağlamak için en az 500 defa geri ve ileri-hareketi tekrarlayın. 01:01 su-yağ emülsiyonu son karıştırma sonra, kullanıma hazır ve 10 mg / ml hipofiz protein konsantrasyonu içerir. Emülsiyon arkadaşı vallahi makalede ayrıntılı olarak, aynı gün anestezi SJL farelere subkutan enjekte olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1962 4 otoimmün hipofizitis ile ilk hasta rapor olmasına rağmen, patojen hipofiz otoantijenler 5 tanımlanabilir kalır. Hayvan modelleri, hasta bakımı çevrilebilir biyobelirteç keşif yardım, bu otoantijenler tanımlamak için çok yararlı olabilir. Bu makale, deneysel hayvanlarda otoimmün hipofizitis inducing için yeterli bir form hipofiz proteinler hazırlamak için basit bir işlemdir göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma PC NIH hibe DK080351 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
