Summary
Hypophysitis אוטואימוניות ניתן לשחזר בעכברים באמצעות הזרקת תמצית של חלבונים עכבר יותרת המוח.
Abstract
Hypophysitis אוטואימונית היא דלקת כרונית של בלוטת יותרת המוח הנגרמת או מלווה אוטואימוניות 1. זה באופן מסורתי נחשב מחלה נדירה אך דיווח גדל במידה ניכרת בשנים האחרונות. Hypophysitis, למעשה, מפתחת לא יוצאת דופן כמו "תופעת לוואי" אצל חולי סרטן שטופלו עם נוגדנים החוסמים קולטנים מעכבות הביע על לימפוציטים מסוג T, כגון CTLA-4 2 ו PD-1 קולטנים. Hypophysitis אוטואימונית יכול להיגרם על ידי הזרקת בניסוי בעכברים עם חלבונים יותרת המוח מעורב עם 3 adjuvant. במאמר זה וידאו אנחנו מדגימים כיצד לחלץ חלבונים מן העכבר בלוטות יותרת המוח ואיך להכין אותם בצורה מתאימה גרימת hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL.
Protocol
ניסיוני פרוטוקול
הצעד הראשון פרוטוקול הניסוי הזה היא לאסוף מספר גדול של בלוטות יותרת המוח העכבר. הצעד השני הוא homogenize בלוטות להכין תמצית חלבון. הצעד השלישי הוא emulsify החלבונים האלה בתערובת שמנוני.
שלב 1: איסוף ואחסון של העכבר בלוטות יותרת המוח
בלוטת יותרת המוח העכבר יושב בבסיס הגולגולת בשקע של העצם יתדי שנקרא יושבת הבלוטה סלע, מוקף רוחבית על ידי העצבים trigeminal ו anteriorly ידי התצלובת הראייה. בלוטה מורכבת של האונה הקדמית גדול האונות האחורי ביניים קטנות יותר, ומשקלו על 1.9 מ"ג בממוצע. בלוטות יותרת המוח נאספים מעכברים של זנים, מינים מעורבים, הגילאים, נועד להיות מורדמים באמצעות מתקן טיפול בבעלי חיים.
כדי לבודד את בלוטת יותרת המוח, העכבר הוא מורדמים, העור מעל הגולגולת גזור, ואת עצם הגולגולת לחתוך לפתוח במספריים. המוח הוא הרים לחשוף את בלוטת יותרת המוח, אשר מבודדת אז מן מאטר הדורה שמסביב, הנדלה העצם יתדי ומאוחסנים צינור פלסטיק על קרח יבש.
בדרך כלל אנו משתמשים 300 בלוטות יותרת המוח עכבר להכנת חלבון אחד, מספר כי ניתן לאסוף על ידי אדם אחד ב 9 שעות.
לאחר איסוף הושלמה, שפופרת המכילה את בלוטות יותרת המוח מאוחסן ב -80 ° C עד מוכן לשלב הבא.
שלב 2. הפקת עכבר יותרת המוח חלבונים
- מוסיפים את החיץ homogenization לצינור פלקון 15 מ"ל (קטלוג לא 352,059) שמר באמבט קרח, באמצעות 250 μL של המאגר על כל 100 בלוטות יותרת המוח שנאספו. השתמש חיץ של חוזק היוני דומה לזו שקיימת פיזיולוגית בתוך הציטופלסמה של התא (0.2 מ ') של ה-pH פיזיולוגי (7.4). אנו משתמשים פוספט שנאגרו מלוחים (0.161 M, pH 7.4), בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז (סיגמא אולדריץ, קטלוג לא P8340-1ML).
- מוסיפים את בלוטות יותרת המוח למאגר רק לפני homogenization, ולאחר מכן למקם את מחולל (5 מ"מ קוטר) של homogenizer Polytron בתחתית הצינור פלקון. Homogenize בסל"ד מרבי למשך 30 שניות, בעדינות להזיז את הצינור פלקון למעלה ולמטה תוך שמירה על אותה באמבט קרח. לאחר מכן, שאר homogenate על קרח דק 1. חזור על homogenization וקירור צעדים עוד פעמיים. זה homogenization עדין צריך לשבור את התאים לשחרר חלבונים cytosolic מבלי לשבש את הגרעינים.
- כדי להסיר, גרעינים שלמים רקמות וחומרים מסיסים (כגון רקמת החיבור ואת קומפלקסים חלבונים מפוגל), בצנטריפוגה homogenate במהירות נמוכה (1000g) במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את supernatant (נקרא כעת פוסט גרעיני Supernatant, PNS) לצינור פלקון חדש, מקפיד להשאיר גלולה באין מפריע, ולאחסן את PNS על הקרח.
- Resuspend גלולה בהיקף המקורי של חיץ homogenization (250 μL של המאגר על כל 100 בלוטות יותרת המוח שנאספו), homogenize לעיל, צנטריפוגה לעיל, ולאחר מכן לשלב את PNS השני עם הראשון.
- Aliquot שני PNS אספו דגימות לתוך צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לשלב הבא. הכנה זה החלבון ניתן לאחסן -80 ° C אבל לאט לאט מאבד את העוצמה שלה, לכן אנו ממליצים להשתמש בו בתוך 6 חודשים מיום ההכנה. השתמש aliquot קטן כדי לקבוע את התשואה חלבון ריכוז ידי assay BCA (קטלוג פירס לא. 23,225), ואת איכות החלבון על ידי ג'ל אלקטרופורזה. באופן כללי, אנו מקבלים על 60 מ"ג של חלבון מן 300 מ"ל יותרת המוח העכבר של 1.5 חיץ homogenization, בריכוז סביב 40 מ"ג / מ"ל.
שלב 3. הכנת התחליב עבור חיסון
- הפשירי במהירות aliquots חלבון קפוא הדרושים לניסוי ולהתאים את ריכוז החלבון עד 20 מ"ג / מ"ל. תמצית חלבון זה יהיה emulsified 01:01 עם adjuvant השלם של פרוינד (CFA, Sigma-F-5881) המכיל 5 מ"ג / מ"ל של חום הרג Mycobacterium tuberculosis (בקטון דיקינסון, 231,141). עכבר יקבל 1 מ"ג של תמצית יותרת μL 100 של אמולסיה.
- הדוגמה שניתנה כאן היא מחסנת 10 עכברים, שבו כל העכבר יהיה הזריקו μL 100 של תחליב המכיל 1 מ"ג של חלבונים יותרת המוח. אפשר שני עכברים נוסף עבור אובדן חומר במהלך תקופת ההכנה, כדי להשתמש 12 מ"ג של חלבונים יותרת המוח. Aspire 600 μL של לחלץ את מ"ג / מ"ל 20 חלבון יותרת המוח לתאר לעיל באמצעות מזרק 2.5 מ"ל המילטון gastight. Resuspend CFA ידי רועדות, שואפים 600 μL של CFA לתוך מזרק נוסף המילטון 2.5 מ"ל. צרף ומאובטח 22-מד מיקרו emulsifying מחט המזרק מלא CFA. לאט לאט לדחוף את הבוכנה של המזרק CFA כך את המחט מלא CFA, אז לצרף ו לאבטח את הקצה השני שלהמחט במזרק מלא לחלץ יותרת המוח.
- לאט לאט לקדם את הבוכנה של המזרק CFA לדחוף את מרכיב שמן לתוך לחלץ את acqueous יותרת המוח, כך רק כמות קטנה מעורבת. ואז להדוף את הבוכנה של המזרק לחלץ יותרת המוח לתוך המזרק CFA. חזור על פעולה זו בהדרגה את כמות החומר מעורבת. המשך עד התוכן של שני מזרקים מעורבבים. תוכלו לקבל פתרון לבנבן ומופץ באופן שווה המייצג את תחליב מים בתוך שמן.
- לאחר שנוצר תחליב, לחזור על תנועה אחורה-and-הלאה לפחות 500 פעמים על מנת להבטיח את האמולסיה הוא מעורב באופן יסודי. לאחר מחזור הערבוב הסופי, 01:01 מים ב-תחליב שמן מוכן לשימוש מכיל ריכוז חלבון יותרת המוח של 10 מ"ג / מ"ל. התחליב יהיה להזריק באותו יום תת עורי לעכברים SJL הרדים, כמפורט במאמר יופיטר לוויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות העובדה כי החולה הראשון עם hypophysitis אוטואימוניות דווחה בשנת 1962 4, autoantigens פתוגניים יותרת המוח נשארים להיות מזוהה 5. במודלים של בעלי חיים יכול להיות מאוד שימושי כדי לזהות אלה autoantigens, בסיוע גילוי סמנים כי הם לתרגום על הטיפול בחולה. מאמר זה הוכיח הליך פשוט להכנת חלבונים יותרת המוח בצורה שהיא מתאימה גרימת hypophysitis אוטואימוניות בחיות מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק DK080351 למחשב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
