Summary
면역 hypophysitis는 마우스 뇌하수체의 단백질 추출물을 주사로 쥐 복제하실 수 있습니다.
Abstract
면역 hypophysitis가 발생하거나 autoimmunity 1과 함께 뇌하수체의 만성 염증이다. 그것은 전통적으로 희귀한 질병으로 간주 되었으나보고 최근 몇 년 동안 현저하게 증가하고 있습니다. Hypophysitis는 사실, 이러한 CTLA - 4 2, PD - 1 수용체와 같은 T lymphocytes에 표현 억제 수용체를 차단하는 항체로 치료 암 환자의 '부작용'로 쓰시하지 개발하고 있습니다. 면역 hypophysitis는 도움이되는 3 혼합 뇌하수체 단백질과 쥐를 주사하여 실험적으로 유도된 수 있습니다. 이 동영상이 문서에서 우리는 마우스 뇌하수체 분비 및 SJL 생쥐의 면역 hypophysitis를 유도에 적합한 형태로 그들을 준비하는에서 단백질을 추출하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
실험 프로토콜
이 실험 프로토콜의 첫 번째 단계는 마우스 뇌하수체의 땀샘의 다수를 수집하는 것입니다. 두 번째 단계는 단백질 추출물을 준비하기 위해 분비를 균질하는 것입니다. 세 번째 단계는 기름 혼합 이러한 단백질을 유상으로 만들다하는 것입니다.
1 단계 : 마우스 뇌하수체 분비의 수집과 저장
마우스 뇌하수체는 시신경 chiasm하여 삼차 신경 및 anteriorly로 옆으로 둘러싸인 쐐기 꼴의 뼈 셀라라는 turcica의 우울증에서 두개골 바닥에 앉아있다. 선은 큰 앞쪽에 엽과 작은 후부와 중간 엽 (叶)으로 구성하고, 평균 1.9 MG에 무게입니다. 뇌하수체 분비는 동물 보호 시설에 의해 euthanized 될 운명 혼합 변종, 성별 및 연령의 마우스에서 수집됩니다.
뇌하수체를 분리하려면, 마우스, 해부 두개골 위의 피부를 euthanized, 그리고 두개골의 뼈를 가위로 잘라 열려 있습니다. 두뇌는 다음 주변 두라 메이터으로부터 격리하는 뇌하수체를 노출 채취한 쐐기 꼴의 뼈 밖으로 훔쳐와 드라이 아이스에 플라스틱 튜브에 저장됩니다.
일반적으로 우리는 하나의 단백질 준비, 9 시간 만에 한 사람에 의해 수집된 수있는 번호는 300 마우스 뇌하수체 분비를 사용합니다.
일단 수집이 완료되면, 뇌하수체 분비가 들어있는 튜브 ° C 준비 때까지 다음 단계 -80에 저장됩니다.
2 단계. 마우스 뇌하수체 단백질의 추출
- 15 ML 팰컨 튜브 (카탈로그 없음 352,059)을하는 균질화 버퍼를 추가 수집 매 100 뇌하수체 분비에 대한 버퍼 250 μL를 사용하여 얼음 욕조에 보관. 셀 (0.2 M)와 physiologic PH (7.4)의 세포질 내부 생리학 존재하는 것과 유사한 이온 강도의 버퍼를 사용합니다. 우리는 칼륨이 테아제 억제제 칵테일 (시그마 - 알드리치, 카탈로그 노 P8340 - 1ML)을 보충 (0.161 M, pH를 7.4) 호수 버퍼 사용합니다.
- 바로 균질 전에 버퍼에 뇌하수체 분비를 추가하고, 다음 팔콘 튜브 하단의 Polytron 균 질기의 발전기 (5 mm 직경)를 놓으십시오. 얼음 목욕에서 유지하면서 부드럽게 위아래로 팰컨 튜브를 이동, 30 초 동안 최대 rpm으로 균질. 그런 다음, 1 분 얼음 homogenate를 놓습니다. 균질를 반복하고 냉각 두 번 더 단계를 반복합니다. 이 부드러운 균질의 세포를 휴식하고 핵을 방해하지 않고 cytosolic 단백질을 출시한다.
- 핵, 손상되지 않은 조직 및 불용성 물질 (예 : 결합 조직 및 변성 단백질 단지 등) 제거하려면 4 10 분 ° C. 낮은 속도 (1,000g)에서 homogenate를 원심 분리기
- , 새로운 팰컨 튜브에 (지금 PNS, 포스트 - 원자력 뜨는라고도 함)를 전송 뜨는 펠렛은 그대로두고 돌보는하고, 얼음에 PNS를 저장합니다.
- 균질화 버퍼의 원래 볼륨 (수집된 모든 100 뇌하수체 분비에 대한 버퍼 250 μL)에서 펠렛을 Resuspend, 상기 균질 위와 같이 원심 분리기, 다음 첫 번째와 두 번째 PNS를 결합.
- -80에서 microcentrifuge 튜브 및 저장소로 나누어지는가 두 풀링 PNS 샘플 ° C 다음 단계에 대한 준비까지. 이 단백질 준비는 -80에서 저장할 수 있습니다 ° C 있지만 점차 그 힘을 looses, 그래서 우리가 준비로부터 6 개월 이내에 그것을 사용하는 것이 좋습니다. 겔 전기 영동으로 단백질 수율 및 농도 BCA 분석에 의해 (NO 피어스 카탈로그. 23,225), 그리고 단백질의 품질을 결정하는 작은 나누어지는을 사용합니다. 일반적으로, 우리는 40 MG / ML 주변 농도에서 균질화 버퍼의 1.5 ML 300 마우스 pituitaries에서 단백질의 약 60 MG를 구하십시오.
3 단계. 예방 접종에 대한 감광 유제의 준비
- 빠르게 실험에 필요한 냉동 단백질 aliquots을 녹여 20 MG / ML에 단백질 농도를 조정합니다. 이 단백질 추출물 5 MG / Mycobacterium 결핵 (백톤 디킨슨, 231,141)를 죽이고 열을 ML을 포함하는 완전한 프로 인드의 도움이되는 (CFA, 시그마 F - 5881)로 1시 1분을 유화 것입니다. 각 마우스 에멀전 100 μL에 뇌하수체 추출의 1 밀리그램을 받게됩니다.
- 여기에 주어진 예제는 각 마우스가 뇌하수체 단백질의 1 MG를 포함하는 유제 100 μL로 주입됩니다 10 마우스를 immunizing입니다. 준비하는 동안 재료의 손실의 두 가지 별도의 마우스를 허용하므로 뇌하수체 단백질 12 MG를 사용합니다. 20 MG / ML 뇌하수체 단백질 추출물의 바램이 600 μL은 2.5 ML 해밀턴 gastight의 주사기를 사용하여 위에서 설명합니다. 흔들림으로 CFA를 Resuspend, 다른 2.5 ML 해밀턴 주사기로 CFA 600 μL를 열망. 첨부와 CFA 가득한 주사기에 22 게이지 마이크로 emulsifying 바늘을 확보. 천천히 바늘이 CFA으로 가득합니다 이러한 CFA의 주사기의 플런저를 밀어 후 첨부의 다른 쪽 끝을 확보뇌하수체 추출 가득 주사기에 바늘.
- 천천히 단지 소량이 혼합되어 같은 acqueous 뇌하수체 추출물로 오일 구성 요소를 밀어 CFA의 주사기의 플런저를 전진. 다음 CFA의 주사기에 뇌하수체 추출 주사기의 플런저를 뒤로 밀어. 점차적으로 혼합 물질의 양을 증가이 작업을 반복합니다. 두 주사기의 전체 내용이 혼합 때까지 계속합니다. 당신은 물 - 인 - 오일 에멀젼을 나타내는 약간 흰하고 고르게 분산 솔루션을 얻을 것입니다.
- 유제가 형성되면, 유제가 완전히 혼합되도록 적어도 500 번 백업 및 앞뒤 움직임을 반복합니다. 최종 혼합 사이클 후 1시 1분 물 - 인 - 오일 에멀젼 사용 준비가되어 10 MG / ML의 뇌하수체 단백질 농도가 포함되어 있습니다. 유제가로 동반자 조브 문서에서 자세한 내용, subcutaneously anesthetized SJL 마우스로 당일에 주입됩니다.
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Discussion
면역 hypophysitis와 함께 첫 번째 환자는 1962 4보고했다는 사실에도 불구하고, 병원성 뇌하수체 autoantigens 5를 식별하기 위해 남아있다. 동물 모델은 환자 치료에 번역 아르 생체의 발견을 은닉이 autoantigens을 파악하는 것은 매우 유용할 수 있습니다. 이 문서는 실험 동물에서 면역 hypophysitis를 유도에 적합 형태로 뇌하수체 단백질을 준비 간단한 절차를 시연했다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 PC에 NIH 부여 DK080351에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
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