Summary

تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان

Published: December 18, 2010
doi:

Summary

مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة هو فحص في المختبر الذي الأسلاف لدم شكل مستعمرات في وسط شبه صلبة. وتستخدم مجموعة من التشكل مستعمرة ، مورفولوجيا الخلايا ، والتدفق الخلوي لتقييم قدرة الأسلاف لتتكاثر والتفريق على طول الأنساب مختلفة للدم.

Abstract

وعادة ما يتم الحصول على الإنسان الجذعية المكونة للدم / السلف الخلايا من نخاع العظام ، دم الحبل السري ، أو الدم المحيطي وتستخدم لدراسة وleukemogenesis تكون الدم. لديهم القدرة على التمايز إلى الأنساب اللمفاوية والدم النخاعي. يستخدم مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة لدراسة انتشار والتفريق بين نمط الأسلاف للدم من خلال قدرتها على شكل مستعمرات في المتوسط ​​نصف صلبة. عدد والتشكل في المستعمرات التي تشكلها على عدد ثابت من الخلايا الإدخال توفير المعلومات الأولية حول قدرة الأسلاف للتمييز وتتكاثر. يمكن حصاده من مستعمرات الخلايا الفردية أو من لوحة كاملة لمواصلة تقييم أعدادهم والدول تمايز باستخدام التدفق الخلوي والتقييم من مورفولوجية بالغيمزا الملطخة الشرائح. هذا الاختبار هو مفيد لتقييم التمايز النخاعي اللمفاوية ولكن لا. يستخدم مصطلح النخاعي في هذا السياق بمفهومها الواسع ليشمل الأنساب المحببات ، الوحيدات ، محمر ، والنواءات.

وقد استخدمنا هذا الاختبار لتقييم آثار المسرطنة على تمايز الخلايا الأولية + CD34 الإنسان المستمدة من الدم المحيطي. لهذا الغرض هي الخلايا transduced مع بناء التحكم إما فيروسات أو بناء التعبير عن الجين الورمي من الفائدة ، في هذه الحالة ، NUP98 HOXA9. نحن نوظف متجه استخداما فيروسات ، MSCV – IRES – GFP ، أن يعبر عن مرنا bicistronic الجينات التي تنتج من الاهتمام وعلامة GFP. هي خلايا ما قبل تفعيلها من خلال تزايد في وجود السيتوكينات لمدة يومين قبل تنبيغ فيروسات. بعد يومين آخرين ، يتم عزل الخلايا GFP + الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) ومختلطة مع methylcellulose المتوسطة التي تحتوي على نصف صلبة تستكمل مع السيتوكينات وحضنت المستعمرات حتى تظهر على السطح ، وعادة 14 يوما. يتم توثيق عدد والتشكل من المستعمرات. ثم تتم إزالة الخلايا من لوحات ، وغسلها ، عدها ، وتعرض للفحص التدفق الخلوي والمورفولوجية. التدفق الخلوي مع الاجسام المضادة المحددة لعلامات سطح الخلية التي أعرب عنها أثناء تكون الدم يوفر معلومات حول نسب ومرحلة النضج. الدراسات المورفولوجية الخلايا الفردية تحت المجهر بعد رايت تلوين غيمزا تقديم مزيد من المعلومات فيما يتعلق الانساب والنضج. transduced مقارنة مع خلايا مكافحة ناقلات الفارغة لتلك transduced مع الجين الورمي يكشف عن الآثار المترتبة على الجين الورمي على تمايز للدم.

Protocol

1. إعداد الكواشف إعداد الحلول العقيمة الأسهم 1000x من وزراء الخارجية ذات الصلة كيناز التيروزين 3 (FLT – 3) يجند ، محببة / بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM – CSF) ، الخلية الجذعية عامل (SCF) ، ثرومبوبويتين (TPO) ، انترلوكين (IL) -3 وIL – 6 وفقا لتع…

Discussion

وقد استخدم على نطاق واسع CFC مقايسة لتحديد أنماط انتشار والتفريق بين الأسلاف والمكونة للدم لدراسة آثار المسرطنة (4 ، 5). لها ميزة على الثقافات السائل من كونه مقايسة نسيلي ، ان هذه المستعمرات تمثل سلالة من سلف واحد ويمكن إزالتها بشكل فردي لمزيد من التحليل. الحد من مقايسة C…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر J. ألفين Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب ومستشفى بارنز اليهودي في سانت لويس ، MO ، لاستخدام سرعة عالية كور فارز الخلية ، التي وفرت المعدات التدفق الخلوي وخدمات الفرز. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL082549 وHL084179 K02 (NRY). ويدعم مركز للسرطان Siteman جزئيا عن طريق دعم مركز سرطان NCI P30 CA91842 المنحة.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
IMDM   Life Technologies 12440  
FBS   StemCell Technologies 06150  
L-Glutamine   Life Technologies 25030  
Penicillin/Streptomycin (PS)   Life Technologies 15140  
FLT-3 ligand   Peprotech 300-19  
GM-CSF   Peprotech 300-03  
SCF   Peprotech 300-07  
TPO   Peprotech 300-18  
IL3   Peprotech 200-03  
IL6   Peprotech 200-06  
Bovine Serum Albumin   Sigma- Aldrich A7030  
EDTA   Fisher Scientific BP118  
Retronectin   Takara Bio Inc T100A  
HBSS   Life Technologies 14175  
PBS   Life Technologies 14200  
Trypan Blue solution (0.4%)   Sigma-Aldrich T8154  
Methocult GF+ H4435   StemCell Technologies 04445  
Human Methylcellulose Enriched Media   R & D Systems HSC005  
Wright/ Giemsa stain   Harleco 64571  
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula   Ricca Chemical Company 1450  
Methanol   Fisher Scientific A412-4  
Cytoseal 60   Thermo Scientific 8310  
Normal Mouse Serum   Rockland Immunochemicals D208  
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555388  
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551378  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555537  
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551336  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
24-well non-treated tissue culture plates   BD Biosciences 35-1147  
30 mm non-treated dish   StemCell Technologies 27150  
100 mm tissue culture dish   Fisher Scientific 08-757-12  
Gridded scoring dishes   StemCell Technologies 27500  
15 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2097  
50 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2070  
Syringes 3 ml   StemCell Technologies 28240  
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle   StemCell Technologies 28110  
50 μm CellTrics cell filter   Partec 04-004-2327  
Hemocytometer   Fisher Scientific 0267110  
TPX sample chambers   Thermo Scientific A78710018  
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned   Fisher Scientific 12-550-15  
Shandon filter cards   Thermo Scientific 5991022  
Shandon cytospin slide holder   Thermo Scientific 59920063  
Shandon Complete Staining Assembly 100   Thermo Scientific 100  
Kimwipes   Kimberly-Clark Corporation 34155  
1 μm filter paper   VWR 28307-134  
Inverted microscope   Nikon Diaphot  
Microscope camera   Nikon DS-F11  
Microscope   Olympus BX51  
Microscope camera   Olympus DP71  
Scanner   Microtek Scanmaker 4  
Vortex mixer   Fisher Scientific 12-812  
Tissue culture incubator   Sanyo MCO-18AIC  
Cytospin   Shandon Cytospin 2  
Bench-top centrifuge   Eppendorf 5810-R  
Water purification system   Barnstead Nanopure-Diamond  

References

  1. Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
  2. Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
  3. Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
  4. Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
  5. Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
  6. Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
  7. Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).

Play Video

Cite This Article
Sarma, N. J., Takeda, A., Yaseen, N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (46), e2195, doi:10.3791/2195 (2010).

View Video