En cell-till-cell Macromolecular transport-analys I Planta Använda Biolistic beskjutning
Summary
Makromolekylära handel mellan växtceller kan bedömas genom att tillfälligt uttrycka en fluorescerande-taggade proteinet av intresse samt en analys av intra-och intercellulära distribution av konfokalmikroskopi.
Abstract
Här presenterar vi ett enkelt och snabbt protokoll för att upptäcka och bedöma omfattningen av cell-till-cell makromolekylära transporter i Planta. I detta protokoll är en fluorescerande taggad-proteinet av intresse kortvarigt uttryck i växtvävnad efter biolistic leverans av sin kodning DNA-konstruktion. Intra-och intercellulära distribution av de märkta proteinet analyseras sedan av konfokalmikroskopi. Vi beskriver denna teknik i detalj, vilket ger steg-för-steg-protokoll för att analysen och bedöma omfattningen av symplastic protein transport i tre växtarter, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana och N. tabacum (tobak).
Protocol
Discussion
Nyckeln till framgång för symplastic transporter analysen är att med hög omvandlingseffektiviteten, som möjliggör produktion av statistiskt signifikanta och lätt spårbar signal kluster. Detta kan uppnås genom att använda bladen skördas från friska, robusta växter och förbereda guldpartiklar belagda med en ren och koncentrerad DNA-förberedelser.
Använda bladen på samma tillväxtfas är också avgörande för analysen tillförlitlighet. Plasmodesmal bländare är känt att dif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vårt arbete stöds av anslag från NIH / NIGMS, NSF USDA / NIFA, and Bard till VC.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | ||
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | ||
| Spermidine | Sigma | S0266-1G | ||
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | ||
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. . Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
