Summary
高分子植物细胞之间的贩运，可以通过瞬时表达利益荧光标记的蛋白质，分析其内部和细胞间共聚焦显微镜的分布进行评估。
Abstract
在这里，我们提出一个简单而快速的的协议来检测和评估，在植物细胞与细胞大分子运输的程度。在这个协议中，一个荧光标记的利益蛋白在植物组织中瞬时表达其编码的DNA构建的基因枪交付。标签蛋白内和细胞间的分布是由共聚焦显微镜分析。我们详细描述了这一技术，提供一步一步的协议，以检测和评估symplastic蛋白运输在3个植物物种的程度，拟南芥，烟草benthamiana和N. tabacum（烟草）。
Protocol
背景
Symplastic运输大分子通过植物细胞间的连接，胞间连丝，是许多植物病理学家和生物学家的兴趣。例如，一些病毒蛋白是已知的，规范plasmodesmal大小排斥的限制，以使病毒运动1-3。此外，一些内源性蛋白，其中重要的发展监管，是假设从细胞到细胞的移动，大概是通过胞间连丝，功能非细胞自主4。因此，一个可靠的方法来识别和可视化植物细胞的大分子之间的运输是很大的需求。
1）增长目标植物
转化效率高，健康，植株健壮，应使用。
1。 拟南芥
成长中的环境控制腔亲混合BX在一个锅里拟南芥 （10厘米× 10厘米× 10厘米）与短光照（130-150率μe米-2小号-1光8小时23 ° C/16小时黑暗，20 ° C）和40-65％相对湿度为6至8 周 5 。偶尔施肥，与市售产品形容为 5 。尺寸大于15毫米× 35毫米（长度测量包括叶柄）的叶子选择实验。
2。N。 benthamiana和N. tabacum
成长在环境控制腔锅（20厘米x 20厘米x 20厘米）长光照（16小时在23 ° C 130-150率μe米-2 s - 1时轻亲混合BX厂/ 8小时黑暗，20 ° C）和40-65％相对湿度为7至10周。偶尔施肥与市售产品作为描述。叶尺寸大于50毫米× 70毫米北路benthamiana，或100毫米x 125毫米为N。 tabacum（这些测量长度不包括叶柄）为实验选择。
2）基因枪匣与DNA涂金的制备微粒
这个实验步骤的协议已经详细描述了以前 6 。使用高浓度（〜1微克/微升），以获得最高的转化效率为便于在实验后期，共聚焦显微镜分析以及纯化的质粒DNA，这是非常重要。
这个实验中，重要的是，以确定准备墨盒不高频率变换两个或多个相邻的细胞，同时，因为细胞荧光信号集群关联的数字作为symplastic运输的程度（即指标使用包含一个单细胞的信号表示没有动静，而多节信号集群表示运动）。通过分析蛋白质16-20小时后轰击的表达，可以检查每个墨盒的质量。我们的协议 6生产，产量仅在<3％的表达在这段时间内的所有事件，从而为适合本实验，多节的表达集群的墨盒。
3）DNA包覆微粒交付枪法
- 相同的发展阶段（即具有相同的大小和年龄相同，见步骤1）的叶子，用锋利的刀片取出，并立即将他们面临到一个单位的泡沫塑料表面的背面两侧。叶的背面，代表了基板轰击由于其皮毛密度较低和较薄的角质层。拟南芥的叶子，因为其规模相对较小，应覆盖一块窗口筛网，网格，然后用图钉担保泡沫塑料表面。保持叶片扁平增加粒子传递的效率和在microbombardment组织的损害降到最低。
- DNA包覆微粒（在第1步准备）插入到枪匣。 拟南芥 ，拍摄为1微米的微粒，和140-160 PSI 80-110 PSI的压力为0.6微米的微粒。对于N。 benthamiana和烟草，拍摄为1微米的微粒，和160-180 PSI 100-120 psi的压力为0.6微米的微粒。 拟南芥中 ，我们通常利用叶每一个墨盒，因为每片叶子有足够的表面积只有一杆遍及微粒直径10-12毫米的面积。有了较大的N。 benthamiana和烟叶，多个相同的叶子轰炸是可能的，但是，他们必须做，中期肋骨目标在同一发展阶段的叶面积（见讨论）两侧对称位置。
- 泡沫塑料表面的树叶和删除的地方，我不是3层湿的Whatman滤纸的培养皿中，用封口膜密封的培养皿中，并在室温下孵育36-48小时，允许交付的转基因和其蛋白产物的细胞到细胞的运动潜力表达。
4）蛋白表达的成像
共聚焦显微镜观察荧光信号的瞬时表达标签蛋白。应采取每个测试蛋白质的检测，以寻找最佳的显微镜设置。例如，蛋白质，显示出微弱的信号强度，如烟草花叶病毒运动蛋白（TMV MP）1,2,3,6,9 plasmodesmal本地化，细胞内的积累有限，应观察下一个40X的物镜，提供更高的分辨率和灵敏度，而蛋白质，显示出强烈的信号强度，如免费YFP的，细胞质分布，可以可视化下一个更快的成像焦变焦功能的10X物镜（见图1）。
Symplastic运输含有荧光信号的多节集群的外观推断。这种集群和细胞的数量在每个群集的数量是细胞与细胞之间运输的严重程度的指标。为了获得可靠的数据，至少有100表达集群应记录每每个实验系统。例如，如果一种蛋白质的细胞到细胞的运动是在两个不同的遗传背景（例如，野生型和转基因植物）共200表达集群，相比的应记录在案。更重要的是，实验，其结果是相互比较，应进行同步。
5。代表性的成果
下图给出了有代表性的实验，检测荧光标记的蛋白质symplastic运输。面板A和B的典型的共聚焦图像，得到一个北路以下microbombardment benthamiana一个TMV MP - YFP表达的叶构造。在面板中，TMV MP - YFP symplastic运动观察的基础上YFP的信号多节集群的外观。并非所有的瞬时表达烟草花叶病毒的MP - YFP能够在一些microbombardments（B组）由单细胞信号证明。据统计，在<40％计算的信号集群，烟草花叶病毒的MP - YFP寸步难行，而细胞之间的集群> 60％，蛋白质2-5细胞之间的移动，两个细胞的扩散是最常见的（约〜50％的情况下）（图1C）。
相对较小，没有天生的运动活动分子大小的蛋白质可以通过PD的扩散，细胞与细胞之间移动。例如，YFP的自由，或1xYFP（约27 kDa的，面板ð），价差在30％的计算集群（板三）之间的多个单元格。翻译YFP的调光器，或2xYFP（54 kDa的，面板发送），这是烟草花叶病毒的MP - YFP融合蛋白（57 kDa）的大小相媲美，而这是完全自治的细胞，这种非特定的扩散不会发生（图1C）。
从N 中 symplastic运输检测获得的典型结果见图1。 benthamiana叶组织。 （A，B）的烟草花叶病毒的MP - YFP的可视化。 （三）定量信号集群。 1xYFP和2xYFP，YFP的自由和翻译YFP的二聚体，分别的。 （四）可视化1xYFP。 （五）可视化2xYFP。在显微照片中，左侧面板显示YFP的信号和右面板显示合并后的图像YFP（绿色）和“叶绿体自发荧光（白）信号。图片是单焦部分。星号显示的显微照片显示YFP的信号的表皮细胞。酒吧= 50微米。
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Discussion
symplastic运输检测成功的关键是获得高转化效率，这使得生产的统计学意义，并轻松地探测信号集群。这样就可以实现使用健康，植株健壮收获的叶子，并准备由一个纯粹和浓缩DNA的制备涂层的金粒子。
使用相同的成长阶段的叶子也是检测的可靠性至关重要。 Plasmodesmal光圈差异调节，取决于对组织7-11的发展阶段。许多植物的叶发展basipetally，从顶点到基地，超过其基部 12成熟的叶的顶端部分。因此，不仅是为每个组实验选定的叶片（通常是由它们的大小和位置上干反映）的发展阶段应该是相同的，但叶microbombardment有针对性的地区，应设在相同的位置。
一些早先的研究中所采用的细胞自主的标志，如内质网，拴GFP（erGFP）11，最初区别于symplastic运输移动测试蛋白质转化细胞。然而，后来的研究表明erGFP一些非细胞自主的蛋白质，同时表达可诱导其细胞与细胞运动13，质疑erGFP作为初始变换标记的可靠性，并大幅增加对数据的解释中的困难，从这样的共表达实验。因此，我们宁愿以避免引入到我们的运动检测的另一种蛋白的表达，和，而不是依赖信号集群号码统计分析。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们的工作是由美国国立卫生研究院/ NIGMS，美国国家科学基金会，美国农业部/ NifA的，和Bard补助到VC支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
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