使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ
Summary
この記事では、段階的に記述しようとする、一般的に使用される<em> in vitroで</emシュワン細胞asrtocyte相互作用を研究に使用される>アッセイ。
Abstract
シュワン細胞は、脊髄損傷、以下の修復方法で一般的に使用される細胞の一つです。シュワン細胞は軸索再生をサポートしていると分泌成長因子の1,2により、発芽と接着分子3と細胞外マトリックス分子4を成長促進を提供することが可能です。さらに、彼らは怪我5部位で脱髄軸索をmyelinate。
しかし移植後、シュワン細胞は、インプラントのサイトから移行しないと、ホストアストロ6,7と混合しないでください。シュワン細胞とアストロサイトとの間の鋭い境界の形成にこの結果、近位および遠位宿主組織に移植バックを終了しようとして成長する軸索のための障害物を作成する。シュワン細胞と接触するアストロサイトはまた、肥大とアップレギュレーション阻害分子8-13を受ける。
in vitroアッセイモデルシュワン細胞-アストロサイト相互作用するために使用されており、細胞挙動の根底にあるメカニズムを理解する上で重要な役割を演じてきた。
in vitroアッセイこれらは、共培養は、2つのセルの前線を分離するだけの小さなギャップと異なる地域を占める各セルのタイプと二つの異なる細胞を用いて作られている境界のアッセイを、含まれています。細胞が分裂と移行するように、2つの細胞の前線が近づくごとに、他に取得し、最終的に衝突する。これは2つの細胞集団の振る舞いが境界で分析することができます。同技術のもう一つの変化は、文化の2つの細胞集団を混合し、時間をかけて2種類の細胞型は、シュワン細胞と分離するとともに、複数のシュワン-アストロサイトの境界を作成するアストロサイトとの間の島々として一緒に凝集することです。
2種類の細胞型の相互作用を研究に使用される第二のアッセイは、細胞の動きが他の細胞型単層14,15の表面に追跡することができます遊走アッセイです。このアッセイは、一般的に反転したカバースリップのアッセイとして知られています。シュワン細胞は、小さなガラスの破片上で培養され、それらは、アストロサイト単分子膜の表面に顔を下に反転していると、移行はカバースリップの端から評価される。
両方のアッセイは、細胞の排除と境界形成に関与する根本的なメカニズムの研究に尽力されている。これらの手法を用いて同定された分子の一部はN -カドヘリン15、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPGs）16,17、FGF /ヘパリン18、エペソ/エフリン19を含む。
この記事では、段階的に境界の分析および移行のアッセイを記述すると発生する可能性のある技術的な問題を解明していきます。
Protocol
Discussion
上記のアッセイは、シュワン-アストロサイトとアストロサイトの環境に限定されたシュワン細胞の遊走との間の境界形成に関与する複数の要因の役割を示す様々な研究で使われてきました。
それは戦略の開発を最適化できると移植後のシュワン細胞移植の統合を強化し、そうすることで可能に宿主組織に移植片の背面からの再生軸索の出口を促進するとして、これらの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼女の親切な助けのためにリッパウォーレンに感謝します。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | ||
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | ||
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | ||
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | ||
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | ||
| Coverlips | VWR-International | 631-0149 | ||
| Coverlips(rectangle) | MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics) | BB022050A1 | ||
| Chamber slides | Nunc-LabTek | 177380 | ||
| 4 well plates, 6 well plates | Nunc | 4 well plates 6 well plates |
||
| rat p75 antibody | Millipore, Temecula,California | MAB365 | ||
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | ||
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 |
Goat anti mouse 568 Goat anti Rabbit 488 |
|
| Secondary biotinylated | Vector | Goat anti mouse | ||
| DAB tablets | Sigma-aldrich | D4418 | ||
| ABC elite kit | Vector | PK-6100 | ||
| Fine Forceps | FST | 11295-10 | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | ||
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
