Summary

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Published: January 13, 2011
doi:

Summary

Questo articolo si propone di descrivere in modo graduale comunemente usato<em> In vitro</em> I test eseguiti nello studio delle cellule di Schwann-asrtocyte interazioni.

Abstract

Cellule di Schwann sono una delle celle utilizzate nelle strategie di riparazione dopo le lesioni del midollo spinale. Cellule di Schwann sono in grado di supportare la rigenerazione assonale e germinazione da 1,2 secernono fattori di crescita e fornendo la promozione della crescita molecole di adesione 3 e molecole della matrice extracellulare 4. Inoltre essi mielinizzare gli assoni demielinizzati nel sito di lesione 5.

Tuttavia dopo il trapianto, le cellule di Schwann non migrano dal sito di impianto e non si mescolano con il astrociti ospite 6,7. Ciò si traduce nella formazione di un confine netto tra le cellule di Schwann e gli astrociti, creando un ostacolo per gli assoni in crescita cercando di uscire dal retro innesto nel tessuto ospite prossimale e distale. Astrociti in contatto con le cellule di Schwann anche subire l'ipertrofia e up-regolazione delle molecole inibitori 8-13.

Test in vitro sono stati utilizzati per modellare cellule di Schwann-astrociti interazioni e sono stati importanti per capire il meccanismo alla base del comportamento cellulare.

Questi test in vitro includono test di confine, dove viene effettuata una co-coltura con due cellule diverse con ogni tipo di cellula che occupa diversi territori con solo un piccolo spazio che separa i due fronti della cella. Come le cellule si dividono e migrano, i due fronti cellulare avvicinarsi gli uni agli altri e, infine, si scontrano. Questo consente il comportamento delle due popolazioni cellulari da analizzare al confine. Un'altra variante della stessa tecnica è quello di mescolare le due popolazioni cellulari in coltura e nel corso del tempo i due tipi di cellule segregare con le cellule di Schwann insieme a blocchi come isole in mezzo astrociti insieme creazione di più di Schwann-astrociti confini.

Secondo test utilizzato per studiare l'interazione di due tipi di cellule è il test di migrazione in cui il movimento cellulari possono essere rintracciati sulla superficie del tipo di cellula monostrato 14,15. Questo test è comunemente noto come test coprioggetto invertita. Cellule di Schwann sono coltivati ​​su piccoli frammenti di vetro e sono invertiti a faccia in giù sulla superficie dei monostrati astrociti e la migrazione viene valutata dal bordo del vetrino.

Entrambi i saggi sono stati strumentali per lo studio dei meccanismi connessi alla esclusione cellulare e la formazione di confine. Alcune delle molecole identificate utilizzando queste tecniche includono N-caderine 15, proteoglicani Condroitin Solfato (CSPGs) 16,17, FGF / eparina 18, Ef / efrine 19.

Questo articolo si propone di descrivere test confine e il dosaggio della migrazione in modo graduale e chiarire gli eventuali problemi tecnici che potrebbero verificarsi.

Protocol

1. Contorno di analisi: Preparazione di base: le diapositive Camera sono rivestiti con poli-D-lisina vetrini durante la notte e sterile vengono preparati prima di iniziare l'esperimento. Terreno è preparato utilizzando Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM), integrato con il 10% di siero fetale bovino (FCS), e 1% di penicillina-streptomicina-Fungizon (FPF). Anche una bottiglia di calcio / magnesio soluzione salina bilanciata libero Hanks (HBSS) è preparato. Primarie di cellule di Schwann ratto c…

Discussion

I saggi di cui sopra sono stati utilizzati in diversi studi che dimostrano il ruolo dei molteplici fattori coinvolti nella formazione di confine tra il Schwann-astrociti e limitato la migrazione delle cellule di Schwann in ambiente astrocitaria.

Comprendere la meccanismi alla base di queste manifestazioni è essenziale in quanto consentirebbe lo sviluppo di strategie per ottimizzare e migliorare l'integrazione di innesti cell Schwann dopo il trapianto e in tal modo di facilitare l'us…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Philippa Warren per il suo gentile aiuto.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DMEM   Invitrogen 41966-029  
HBSS   Invitrogen 14170-088  
FCS   Invitrogen 10091-148  
PSF   Invitrogen 15240-062  
BPE   Invitrogen 13028-014  
Forskolin   Calbiochem 344273  
Coverlips   VWR-International 631-0149  
Coverlips(rectangle)   MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics) BB022050A1  
Chamber slides   Nunc-LabTek 177380  
4 well plates, 6 well plates   Nunc   4 well plates
6 well plates
rat p75 antibody   Millipore, Temecula,California MAB365  
GFAP antibody   Dako Z0334  
Secondary antibodies (Alexa-conjugated)   Invitrogen A-11004
A-11034
Goat anti mouse 568
Goat anti Rabbit 488
Secondary biotinylated   Vector   Goat anti mouse
DAB tablets   Sigma-aldrich D4418  
ABC elite kit   Vector PK-6100  
Fine Forceps   FST 11295-10  
Paraformaldehyde   Sigma-Aldrich P6168  
Fluorosave   Calbiochem 345789  

References

  1. Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
  2. Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
  3. Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
  4. Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
  5. Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
  6. Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
  7. Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
  8. Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
  9. Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
  10. Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
  11. Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
  12. Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
  13. Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
  14. Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
  15. Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
  16. Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
  17. Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
  18. Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
  19. Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).

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Cite This Article
T. Afshari, F., C. Kwok, J., W. Fawcett, J. Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays. J. Vis. Exp. (47), e2214, doi:10.3791/2214 (2011).

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