Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios
Summary
Este artigo pretende descrever de forma gradual o comumente usado<em> In vitro</em> Testes usados no estudo de células de Schwann-asrtocyte interações.
Abstract
Células de Schwann são um dos células normalmente usadas em estratégias de reparo após lesões na medula espinhal. Células de Schwann são capazes de apoiar a regeneração axonal e surgimento de secreção 1,2 fatores de crescimento e fornecer factores de crescimento e moléculas de adesão 3 moléculas de matriz extracelular 4. Além disso, eles mielinizar os axônios desmielinizados no local da lesão 5.
No entanto após o transplante, as células de Schwann não migram do local de implante e não se misturam com os astrócitos anfitrião 6,7. Isto resulta na formação de uma fronteira nítida entre as células de Schwann e astrócitos, criando um obstáculo para os axônios em crescimento tentando sair da volta do enxerto no tecido do hospedeiro proximal e distalmente. Astrócitos em contato com células de Schwann também sofrem hipertrofia e up-regular as moléculas inibidoras 8-13.
Ensaios in vitro têm sido usados para modelar Schwann células-astrócitos interações e têm sido importantes para a compreensão do mecanismo subjacente ao comportamento celular.
Estes ensaios in vitro incluem teste de fronteira, onde a co-cultura é feita através de duas células diferentes, com cada tipo de célula que ocupam diferentes territórios, com apenas uma pequena diferença que separa as duas frentes de células. Como as células se dividem e migrar, as duas frentes de celulares se aproximar uns dos outros e, finalmente colidem. Isso permite que o comportamento das duas populações celulares a serem analisados na fronteira. Outra variação da mesma técnica é misturar as duas populações celulares em cultura e ao longo do tempo os dois tipos de células com as células de Schwann segregar aglutinados como ilhas entre astrócitos juntos criando múltiplas Schwann-astrócito limites.
Segundo ensaio utilizado no estudo da interação de dois tipos de células é o ensaio de migração celular, onde o movimento pode ser acompanhado na superfície do tipo de célula outras monocamada 14,15. Este ensaio é comumente conhecido como teste de lamela invertido. Células de Schwann são cultivadas em pequenos fragmentos de vidro e eles são invertidos face para baixo sobre a superfície de monocamadas de astrócitos e migração é avaliada a partir da borda da lamínula.
Ambos os ensaios têm sido fundamentais para estudar os mecanismos subjacentes envolvidos na exclusão celular e formação de fronteira. Algumas das moléculas identificadas usando estas técnicas incluem N-caderinas, 15 de proteoglicanos sulfato de condroitina (CSPGs) 16,17, FGF / Heparina 18, Ef / Efrinas 19.
Este artigo pretende descrever ensaio limite e ensaio de migração de forma gradual e elucidar os possíveis problemas técnicos que possam ocorrer.
Protocol
Discussion
Os ensaios descritos acima têm sido utilizados em vários estudos demonstrando o papel dos múltiplos fatores envolvidos na formação da fronteira entre o Schwann-astrócitos e migração de células de Schwann limitada em ambiente astrocíticos.
Compreensão dos mecanismos subjacentes a estes eventos é essencial, uma vez que permitiria o desenvolvimento de estratégias para otimizar e melhorar a integração de enxertos de células de Schwann após o transplante e com isso facilitar a sa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Filipa Warren por sua ajuda espécie.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | ||
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | ||
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | ||
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | ||
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | ||
| Coverlips | VWR-International | 631-0149 | ||
| Coverlips(rectangle) | MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics) | BB022050A1 | ||
| Chamber slides | Nunc-LabTek | 177380 | ||
| 4 well plates, 6 well plates | Nunc | 4 well plates 6 well plates |
||
| rat p75 antibody | Millipore, Temecula,California | MAB365 | ||
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | ||
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 |
Goat anti mouse 568 Goat anti Rabbit 488 |
|
| Secondary biotinylated | Vector | Goat anti mouse | ||
| DAB tablets | Sigma-aldrich | D4418 | ||
| ABC elite kit | Vector | PK-6100 | ||
| Fine Forceps | FST | 11295-10 | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | ||
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
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