Summary
في هذا البروتوكول ، ونحن إثبات تلفيق مجموعة من الوظائف microactuator عموديا على النازحين الذي يستند إليه التكنولوجيا ، وكيف يمكن تعديل هذه التكنولوجيا لإجراء قاعدة إنتاجية عالية خلية ثقافة ديناميكية ميكانيكيا في كل ثقافة ثنائي الابعاد وثلاثي الابعاد نماذج.
Abstract
غير محدود القدرة على تحقيق منهجية استجابة المختبر الخليوي الى مجموعات من المحفزات mechanobiological للهندسة الأنسجة ، واكتشاف الأدوية الأساسية أو دراسات بيولوجيا الخلايا عن طريق تكنولوجيات مفاعل حيوي الحالية ، والتي لا يمكن أن تطبق في وقت واحد مجموعة متنوعة من المحفزات الميكانيكية إلى الخلايا المستزرعة. من أجل معالجة هذه المسألة ، وقد وضعنا سلسلة من المنصات microfabricated مصممة للكشف عن الآثار المترتبة على محفزات الميكانيكية في شكل عالية الإنتاجية. في هذا البروتوكول ، ونحن إثبات تلفيق مجموعة من الوظائف microactuator المشردين عموديا الذي يستند على التكنولوجيا ، وشرح كذلك كيف يمكن تعديل هذه التكنولوجيا لإجراء قاعدة إنتاجية عالية خلية ثقافة ديناميكية ميكانيكيا في كلا البلدين والأبعاد الثلاثة ثقافة نماذج ثلاثية الأبعاد.
Protocol
ألف وصف وتشغيل الأجهزة
هي ملفقة الأجهزة باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة متعدد الطبقات 1 في polydimethylsiloxane (PDMS) ، وتكون قادرة على توليد نفس الوقت مجموعة من الظروف الميكانيكية في أماكن زراعة الخلايا الفردية عبر مجموعة microfabricated. في هذا البروتوكول ، وصفت لأول مرة خطوات لتلفيق مجموعة من هوائيا ، دفعتها microposts ، تليها خطوات لتعديل الجهاز لتمكين ثقافة ديناميكية ميكانيكيا في كلا نماذج ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثي الابعاد الثقافة (3D). النهج المبين microfabricated زيادة الإنتاجية على الأنظمة القائمة macroscale ، والأنسب لفحص آثار مجموعة متنوعة من الظروف الميكانيكية.
ويستند هذا المبدأ التشغيلي للجهاز على مجموعة من microposts دفعتها عموديا. هي ملفقة Microposts على الحجاب الحاجز بحرية ، مع وقف التنفيذ ، ويتم رفع وخفض الضغوط عن طريق تطبيق الإيجابية والسلبية تحت الحجاب الحاجز يشتغل (الشكل 1). ومن السمات الرئيسية لمجموعة متباينة من قبل هو أن حجم يشتغل الحجاب الحاجز ، ويمكن استخدام مصدر واحد للحصول على ضغط مجموعة من التشريد الرأسي عبر صفيف. ويستخدم هذا المبدأ على الشاشة بسرعة استجابة الخلايا لعدد كبير من الشروط المحفزة الميكانيكية عبر جهاز واحد.
يستند تصميم macroscale مماثلة من قبل شيفر وآخرون 2 ، لدينا تصميم وتشمل الثانية ثقافة الخلية مع وقف التنفيذ ومشحم الفيلم على آخر ، مما يتيح لخلايا لتجربة 2D تشوه الركيزة كما ينزلق الفيلم الثقافة على مدى آخر تحميل المثارة. بدلا من ذلك ، photopatterning مجموعة من الخلايا لادن الهلاميات المائية على الوظائف تحميل يسمح لتحفيز الضغط من الخلايا في الثقافة 3D. تعليمات مفصلة في إعداد هذه النظم متابعة.
باء التصنيع من هوائي المصفوفة microactuator
بتلفيق مجموعة microactuator الهوائية يتطلب صرامة في محاذاة PDMS هياكل متعددة الطبقات. هذا هو التحدي ، وذلك بسبب الانكماش الناجم عن أخطاء التسجيل المحاذاة. للتصدي لهذا ، ونحن نستخدم عملية تلفيق يسمى 'العفن تلفيق شطيرة" 3 ، أظهرت فعالية للقضاء على هذه المشكلة 4.
تحضير مواد
- هي ملفقة واحدة أو متعددة على مستوى الماجستير SU - 8 لكل من مستويات مختلفة في غرف الأبحاث باستخدام الاجراءات القياسية. لهذه الأجهزة ، والماجستير من 200-400 ميكرون سميكة ، اعتمادا على التطبيق. مشوي والماجستير في 80 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام قبل الاستخدام.
- وsilanized الشرائح الزجاجية النظيفة وسادة SU - 8 في فراغ الغرفة ، لمنع التصاق علاج PDMS للمواد. في fumehood ، هو pipetted 60 ميكرولتر من وكيل silanization (tridecafluoro - 1 - ،1،2،2 tetrahydrooctyl) - 1 - trichlorosilane (الولايات المتحدة تكنولوجيا الكيميائية ، وبريستول ، والسلطة الفلسطينية) في طبق بتري في الغرفة. توضع على زجاج العارية وSU - 8 الماجستير في الغرفة وأبقى تحت فراغ بين عشية وضحاها.
- يتم قطع فوم اثنين (متوفر في محلات العرض الحرفية) والنافثة للحبر الشفافية فيلم علوية إلى أحجام أكبر قليلا من سيد SU - 8 يستخدم لتصنيع قالب شطيرة.
شطيرة مقلب التصنيع
- كل طبقة من الجهاز متعدد الطبقات يتطلب طبقة PDMS مصبوب باستخدام هذا الأسلوب. ويرد التخطيطي لعملية تلفيق شطيرة العفن في الشكل 1.
- تمتزج جيدا PDMS مونومر وcrosslinker في نسبة 10:01 القياسية. وتودع 3 مل من مزيج غير مخمر PDMS على الماجستير SU - 8 ملفقة مسبقا ، وdegassed في فراغ الغرفة.
- وضعت وسادة رغوة وSU - 8 الرئيسية على لوحة زجاج شبكي القاعدة.
- وخفضت بعناية على الشفافية في PDMS غير مخمر ، مع التأكد من تجنب محاصرة أي فقاعات هواء. النافثة للحبر الورق الشفاف الخام لديها وجهة على نحو سلس ، وأنه من المهم أن الاتصالات الجانبية سلاسة PDMS غير مخمر.
- يتم وضع شريحة زجاجية silanized على أعلى من الشفافية ، وتحت وسادة رغوة الثاني وأعلى لوحة زجاج شبكي. ومن ثم فرضت الساندويتش معا باستخدام C - المشبك.
- يتم الشفاء من شطيرة PDMS في فرن في 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
- تتم إزالة شطيرة من الفرن وتترك لتبرد قبل إزالة المشبك.
- يتم إزالة المشبك وتفكيكها الساندويتش ، ويتم تجاهل فوم. غير المقشرة بعناية بعيدا عن الشفافية سيد SU - 8 ، والإبقاء على فيلم PDMS منقوشة.
- ويمكن بعد هذه PDMS طبقات وطبقات من نمط التعامل مع الشفافية يتم تخزينها في بيئة خالية من الغبار حتى تكون جاهزة للاستخدام. وقد استخدمنا بنجاح طبقات PDMS تصل إلى شهرين من العمر ، مع تأثيرات ضارة لا ملحوظ.
بناء الجهاز متعدد الطبقات
تي "تقدم> التخطيطي لتصنيع الصفيف microactuator في 2A الشكل ، ويظهر تشغيل المحركات في 2B الأرقام وجيم لافتعال الجهاز :- مستعدة الأدنى منقوشة PDMS طبقة من العفن تلفيق شطيرة. لهذه التجارب ، واستخدمت أنماط دائرية تتراوح ما بين 600 الى 1200μm في القطر.
- ثم يتم نقل طبقة PDMS لشريحة زجاجية نظيفة. وتستخدم وحدة التصريف الاكليل لمعالجة السطوح PDMS والزجاج مع البلازما الأكسجين ، وتوضع على السطوح اثنين في الاتصال مع بعضها البعض. ثم يتم وضع المكدس على موقد في 80 درجة مئوية لإكمال عملية الربط. ويمكن عندئذ أن تكون الشفافية بعيدا مقشر والمهملة. أثناء هذه العملية ، لم يتم الافراج عن الفيلم PDMS منقوشة من ركيزة صلبة ، ومنع الانكماش من طبقات الفردية.
- قد يتوقف على نجاح الخطوة شطيرة صب والأفلام رقيقة من PDMS التي لم تقلص من من بين ميزات SU - 8 والشفافية والحاجة إلى إزالتها. يمكن القيام بذلك يدويا باستخدام إبرة 25G تحت المجسام.
- يتم تشكيل طبقة شطيرة second مصبوب في قالب ومتماثلة السلبية للحجاب الهيكل والوظائف المطلوبة. ذلك لأن تصنيع سادة SU - 8 واسعة المجال هو أمر صعب ، ولكن استخدام عمليات تصنيع بديلة يمكن أن تقضي على هذه الخطوة الإضافية. في هذه المظاهرة ، واستخدمت التعميم المشاركات 500 ميكرومتر في القطر. هو القالب silanized متماثلة السلبية ، واضافته مؤقتا إلى شريحة الزجاج باستخدام الشريط على الوجهين. وتودع PDMS غير مخمر ، وتدور degassed المغلفة على هذا الساندويتش طبقة العفن لمدة 45 ثانية في 1000 دورة في الدقيقة ، مما أسفر عن الحجاب الحاجز an يشتغل 60 ميكرون سميكة. وتدور المغلفة طبقة PDMS جزئيا الشفاء بنسبة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ~ ، أو حتى غير PDMS لزجة ولكن لا تشوه دائم عند لمسها.
- تتم إزالة شريحة زجاجية مزدوجة من جانب والشريط من طبقة PDMS جزئيا الشفاء ، وهو البلازما ثم المعالجة ، ووضع مقلوب في اليجنر مخصصة الصنع. ويتكون من اليجنر تشوك فراغ لنصرة micromanipulator (Siskiyou ؛ بعثة Viego ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). الطبقة الأولى ثم PDMS البلازما المعاملة وضعت على المسرح الدوار (نيومارك والمنح باس ، OR ، الولايات المتحدة) ، تحت تشوك فراغ ، ويلاحظ التوافق بين طبقتين باستخدام آلة تكبير 12X Navitar نظام الرؤية (Navitar ؛ روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة).
- يتم محاذاة الطبقات باستخدام مناور ، وجلبت الى الاتصال بعناية. ثم تتم إزالة شطيرة من اليجنر ، والشفاء في الفرن عند درجة 80 لمدة 30 دقيقة أخرى. ويمكن بعد ذلك من شفافية والعفن silanized PDMS تكون متماثلة مقشر من الجهاز ويتم التخلص منها. ومن ثم شفي تماما من الجهاز عند 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل.
- اعتمادا على نوع تجري تجربة التحفيز الميكانيكي ، يمكن عندئذ إضافية طبقات PDMS تكون المستعبدين على هذا الجهاز قاعدة بتكرار العملية المذكورة. وترد تفاصيل عن أنواع مختلفة من تجارب تحفيز الميكانيكية في الفرعين جيم ودال.
موصلات
- بمجرد اكتمال الجهاز ، يمكن استخدام إبرة لمسح طبقة PDMS في نقطة الاتصال.
- الروابط التجارية مثل Nanoport (أبتشيرتش العلمية ؛ اوك هاربور ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومن ثم يمكن استخدامها للتواصل مع أنابيب خارجية. لتجنب ارتفاع الاحتياجات من الروابط التجارية ، وبالتالي استخدام معيار أطباق بتري كحاويات الجهاز ، نبتدع الخاصة على النحو التالي.
- ويلقي حوالي 35 غراما من PDMS ومملح في علبة المهيمنة وكذلك (نونك ؛ روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة). غير مقشر الجهاز ، ومقطعة إلى أجزاء صغيرة حشية ، والتي تتم إزالة 1 / 8 "ثقب به لكمة.
- يتم استخدام إبرة 18G اضعافها حتى النخاع من مقطع من جانب حشية. يتم استخدام إبرة أصغر 21G لإزالة النواة المركزية قبل سحب الإبرة 18G.
- ويلقي 15G تقريبا PDMS ومملح في غطاء علبة اومني جيدا ، مقشرة ومقطعة إلى الباب ذات الحجم المماثل. ثم يتم تنظيف هذا القسم مع الشريط سكوتش ، البلازما المستعبدين من الجزء العلوي من وحشية ، وحدة البلازما المستعبدين من الجهاز ، الجانب اللكم أسفل.
- ثم يتم فصل ثان 18G إبرة حادة من موصل البلاستيك الملونة luer ، إدراجها في ثقب محفور ومختومة في مكان مع بضع قطرات من PDMS. موصل الناتج هو فعالة جدا واقتصادية ، ولها حجم ميتة مساحة كبيرة بما يكفي لمنع فقاعات الهواء من دخول القنوات السائل خلال مراحل التعبئة.
جيم النشطة ميكانيكيا ركائز الثقافة 2D
يمكن استخدام مجموعة من microposts دفعتها لإنشاء التشكيلات سلالة مختلفة في فيلم البوليمر مع وقف التنفيذ ، والتي يتم استزراع الخلايا. رفع آخر في فيلم مشحم الفيلم لأسباب الانزلاق وتشويه حول آخر. باستخدام آخر تحميل دائري ينتج سلالة equibiaxial التوزيع ، ولكنويمكن استخدام التصميم تنوعا في الأشكال أن آخر المختلفة لخلق مجموعة متنوعة من المجالات السلالة. لتعديل مجموعة المحرك للتجارب ثقافة 2D (التخطيطي في الشكل 3) :
- السندات طبقة PDMS الثالث إلى الجهاز ، كما هو مبين في الشكل 3A. طبقة PDMS الثالثة فتتكون من بنية الطبقة اثنين. انخفاض دائرة يتطابق مع حجم تجويف يشتغل تحت microposts دفعتها. قطر الدائرة العلوية هو 100μm أكبر من قطر وظائف التحميل. A 200 ميكرومتر متناهية واسعة تربط هذه الميزات لمنطقة الصدد ، وسيتم استخدامها لتليين المشاركات التحميل والفيلم الثقافة.
- افتعال والروابط السندات إلى الجهاز ، كما هو موضح سابقا.
- معطف تدور طبقة سميكة من 10-15 ميكرون PDMS على الجانب السلس للشفافية (معلمات تدور : 4000 دورة في الدقيقة ، و 120 ثانية). علاج عند درجة 80 على الأقل 4 ساعات.
- Appy فراغ على مستوى منخفض (Barnant تطلع كاديت مضخة الهواء) إلى المحركات ، وخفض مجموعة من الوظائف.
- البلازما علاج والسندات الفيلم تدور PDMS المغلفة للmicrodevice دفعتها. مكان على موقد في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. فإن وظيفة ويظل ماء ثقافة الفيلم لفترة قصيرة.
- سد قنوات التشحيم مع الجلسرين بنسبة 90 ٪ في محلول الماء منزوع الأيونات. بالإضافة إلى التشحيم ، وهذا يحافظ على صياغة hydrophilicity من PDMS إلى أجل غير مسمى ، وتقليل معامل الاحتكاك. ستبقى فقاعات الهواء المحبوس بين آخر والفيلم الثقافة. وضع الجهاز على موقد في 40 درجة مئوية ، والاستمرار في ضخ مواد التشحيم في القناة ، مما تسبب في زيادة الضغوط الصغيرة. بعد بضع دقائق ، وفقاعات الهواء المنتشر من خلال PDMS ، وسيتم مشحم جميع الأسطح.
- إزالة الضغط السلبي ، والإفراج عن وظيفة.
- باستخدام مشرط ، وقطع حول الفيلم PDMS رقيقة. قشر بعناية شفافية بعيدا عن دعم الجهاز.
- البلازما السندات من ناحية قطع PDMS طوقا حول منطقة الجهاز الثقافة.
- تعقيم الجهاز عن طريق النقع في الإيثانول 70 ٪ لمدة 5 دقائق ، ثم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة.
- البلازما معالجة المياه السطحية واحتضان مع الكولاجين ميكروغرام / 100 مل (أو بديل ECM البروتين) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الجهاز مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، وخلايا البذور في الخلايا 10-15000 / سم 2 ، والبروتوكولات القياسية التالية ثقافة الخلية.
وقد نشرت توصيف مفصل لعملية microdevice والتجارب البيولوجية التي أجريت على هذا المنبر في مكان آخر 7.
دال نشطة ميكانيكيا الهلاميات المائية 3D
ويمكن أيضا إدخال تعديلات على الجهاز يمكن استخدامها لتمكين ضغط photopatterned. خلية لادن ، ثلاثي الأبعاد الهلاميات المائية بطريقة عالية الإنتاجية. في هذا المثال ، فإننا نخلق قطرها 350 ميكرون البولي ايثيلين جلايكول هيدروجيل اسطوانات (PEG) ، التغليف C3H10T1 / 2 الخلايا الجذعية الوسيطة ، وتطبيق سلالات الضغط تتراوح بين 5 إلى 25 ٪ عبر صفيف. ويمكن استخدام هذا البروتوكول مع أكثر تقدما كيمياء هيدروجيل بلمرة ضوئية المنشأ. لاستخدام منصة للتجارب في ثلاث الأبعاد mechanobiology (التخطيطي في الشكل 4) :
الجهاز التعديلات :
- معطف المشاركات بطبقة سميكة من 1 ميكرون C - Parylene للحد من الغاز وتحسين نفاذية مرات البلمرة في نظام الربط هيدروجيل. وهذا سيقلل من الآثار السامة للخلايا للتفاعل الحر بلمرة ضوئية المنشأ الراديكالية مقرا لها. وتستخدم قطعة من الشريط سكوتش لإخفاء المناطق المحيطة آخر ، والمغلفة الجهاز في نظام التوزيع العام 2010 LabCoter 2 (نظم طلاء التخصص ؛ انديانابوليس ، IN ، الولايات المتحدة).
- يتم إزالة الجهاز المغلفة من نظام طلاء ، والشريط سكوتش مقشر بعيدا ، وترك طبقة من امتثالي C - Parylene على وظيفة.
- غير ساترة والزجاج methacrylated 8 عن طريق الغمر في محلول V / V 2 ٪ من 3 -- (trimethoxysilyl) ميتاكريليت بروبيل في الإيثانول 95 ٪ لمدة 2 دقيقة.
- يتم شطف وساترة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ويخبز في 100 درجة مئوية ، وترك الجماعات ميتاكريليت على السطح.
- وادلى 200 ميكرومتر هل PDMS سميكة الفيلم في طبق بتري ، ومقطعة إلى أجزاء صغيرة. أربعة من هذه المقاطع الصغيرة هي البلازما المستعبدين حول حافة methacrylated ساترة.
- ثم يتم الفواصل البلازما المستعبدين لPDMS المناطق للجهاز ، وتغطي الوظائف Parylene - C المغلفة.
- يتم تعقيمها بواسطة جهاز الغسيل في الايثانول 70 ٪ ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة.
البلمرة في الموقع :
ثم كانت الهلاميات المائية PEG الخلية محملة photolithographically منقوشة في الأجهزة 8،9 على النحو التالي :
- يعد 10 ٪ ث / ت PEGDA (3.4kDa ، Laysan بيو ؛ العربية ، AL ، الولايات المتحدة) و 10 ٪ ث / PEG الخامس (8kDa ، سيغما الدريخ)الحل في وسائل الاعلام unsupplmented ثقافة الخلية.
- إعداد محلول المخزون photoinitiator من 100 ملغ / مل من Irgacure 2959 (سيبا الكيماويات المتخصصة ؛ تاريتاون ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) في pyrolidinone - 1 - 2 - الفينيل.
- مزيج دقيق من الحلين معا على استعداد للحصول على حل مع تركيز 0.4 ٪ وزن / حجم من photoinitiator. فلتر الخليط من خلال تصفية 0.45 ميكرون حقنة لتعقيم وإزالة الجسيمات.
- يعرض للتريبسين الثقافات الخلية وإعداد تعليق خلية في وسائل الإعلام والثقافة ، وعلى ضعف التركيز المطلوب الخلية نقطة النهاية.
- مزيج تعليق الخلية وتصفيتها هيدروجيل حل السلائف / photoinitiator في نسبة 1:1.
- حقن المحلول في microdevice باستخدام إبرة طويلة 25G. تجنب بعناية محاصرة الفقاعات في الجهاز.
- محاذاة قناع الشفافية المطبوعة إلى علامات التوافق على سطح الجهاز. اقامة نظام الإضاءة فوق البنفسجية لتقديم جرعة الأشعة فوق البنفسجية بنسبة 17.5 ميغاواط / سم 2 على سطح الجهاز. تضيء هيدروجيل من خلال القناع عن 195 ثانية. وقد تم تحسين هذه المرة لنظامنا ، وربما تحتاج إلى تعديل.
- يغسل السلائف هيدروجيل unpolymerized حل مع برنامج تلفزيوني ، واستبدال ثقافة برنامج تلفزيوني مع وسائل الاعلام. تحفيز الوظائف تحميل لضغط يبني هيدروجيل.
وقد نشرت توصيف مفصل لعملية microdevice والتجارب البيولوجية التي أجريت على هذا المنبر في مكان آخر 10.
هاء المعدات الطرفية
وتستخدم تعديل أطباق بتري للحفاظ على عقم الثقافات الخلية خلال يشتغل من الأجهزة. هو epoxied إبرة اضعافها وتجريد 18G في حفرة حفرها في الجانب طبق بتري. أنابيب (كلاي ادامز Intramedic PE190 ؛ VWR الدولية ، أرلينغتون هايتس ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) هو الضغط المجهزة لهذه الروابط ويتصل اللولبي صمامات التحكم ومصدر الضغط.
وتقدم لضغوط من قبل الأجهزة micropumps الخارجية. للتجارب 2D ، وقد تولدت قيم الضغط الايجابي 30-55 كيلوباسكال باستخدام الجهد الذي تسيطر مضخة الحجاب الحاجز غريب الأطوار (SP 500 EC - LC 4.5VDC ؛ شوارزر دقيقة ، ألمانيا). ويستخدم العرض تحكم نبض تحوير الجهد القائم على تطبيق تختلف الجهد للسيطرة على الضغط الناتج. وتستخدم لخلق ضغط الموجي دوري ؛ اللولبي الصمامات والفتحات (Pneumadyne بليموث ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية S10MM - 30 - 12 - 3 و MSV10 1). ودفعتها الصمامات مع اشارة V 12 ، التي تسيطر عليها مولد الموجي وظيفة مربع.
F. توصيف الأجهزة واستخدامها
التصوير على الجهاز
وهناك قضية مشتركة مع التصوير أو جزيئات الخلايا على الجهاز البصري هو قرار الفقراء نظرا لتكثيف قطرات تحت الفيلم PDMS دعم آخر التحميل. هذا التكثيف تنشأ عن الاختلافات في درجة الحرارة والرطوبة داخل الحاضنة وبعد التثبيت أو على مرحلة المجهر. لحل هذه المشكلة :
- توصيل الخزان مفتوحة للضغط مدخل الميناء ، وملء مع الماء منزوع الأيونات. نستخدم حقنة مفتوحة مع موصل قفل luer للراحة.
- مكان الجهاز وملأ الخزان في فراغ الغرفة ، ومضخة أسفل.
- انتظر 5 دقائق ، وجلب إلى غرفة الضغط الجوي. كرر مرتين أو ثلاث مرات. كما المشردين الهواء من قنوات الجهاز ، يتم استبداله مع المياه من الخزان ، والقضاء على المكثفات الحبرية وتوفير مسار واضح للفحص المجهري الضوئي.
- مجالات الثقافة صورة مشرقة أو باستخدام الحقل المجهري مضان.
لتصوير الخلايا الحية ، ويمكن أن يتم هذا الإجراء قبل البذر الخلايا على الأجهزة. ومع ذلك ، يجب أن تصمم قنوات كبيرة بما يكفي لمنع أي خسائر لزج من بين وحدات الضغط على الجهاز.
من خلال تتبع سلالة توصيف حبة
على أنظمة الثقافة 2D :
- 1 تمييع الخرز قطرها ميكرون فلوري (الدوي المختبرات ؛ فيشر ، IN) في الميثانول إلى التركيز المطلوب. تم العثور على التخفيفات من 1:150 من تركيزات الأصلي (1 ٪ المواد الصلبة العازلة في حل حبة) لتكون مناسبة لاحتياجاتنا.
- البلازما علاج سطح الجهاز ، وإيداع ميكرولتر من 50-10 حبة تعليق.
- انتظر حتى يتبخر الميثانول. إذا كرر حبة تركيز منخفض جدا.
- صورة خلية مجالات الثقافة في راحة ، وتحت حمولة.
- ويمكن عندئذ مفتوحة المصدر تتبع الجسيمات الآلي خوارزميات يمكن استخدامها في ImageJ (NIH) لتعقب التشريد حبة.
- ويمكن بعد ذلك حجم التشرد والتوجيه والمعلمات موقع يمكن استخدامها في نموذج رياضي لوصف الحقول الضغط على سطح الجهاز.
ويمكن اتباع إجراء مماثل لتوصيف السلالات في نظم 3d. المزيج كمية من الخرز الفلورسنت في حydrogel السلائف الحل. في حالة نظام هيدروجيل PEG ، وأحجام المسام هي أصغر بكثير من تلك التي من الخرز قطرها ميكرون 1. يتم تغليف حبات في هيدروجيل ، ويمكن تصوير النظام باستخدام المجهر مبائر. ويمكن بعد ذلك تشريد حبة يمكن تعقب وتحليلها وتركيبها على نموذج تشوه.
G. نتائج الممثل
وترد نتائج ممثلة لتصنيع الجهاز ، وتوصيف وتشغيل في الأرقام 5 و 6.
الشكل 1. تلفيق عملية ساندويتش العفن. (A) هو خفض النفقات العامة بعناية ومن الشفافية على PDMS غير مخمر على الماجستير SU - 8. (ب) يتم وضع شطيرة في كومة الرغوة ، والزجاج والمعدن ، والشفاء في الفرن تحت الضغط. (C) هو تفكيك المكدس وشفافية بعيدا مقشر ، والإبقاء على PDMS نمط طبقة 3. تتكرر بإذن من معهد الفيزياء.
الشكل 2. تخطيطي للmicropost دفعتها عموديا في (أ) والباقي (B) عندما دفعتها. (C) اللازمة لعملية التصنيع تخطيطي متعدد الطبقات لإجراء مجموعة من microposts 3. تكييف بإذن من معهد الفيزياء.
الشكل 3. عملية لتعديل مجموعة microactuator لإجراء التجارب على الخلايا المستزرعة على ركيزة ثنائية الأبعاد تشويه 7. تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
الشكل 4. عملية لتعديل مجموعة microactuator لإجراء التجارب على الخلايا المستزرعة في ثلاثي الأبعاد هيدروجيل photopatterned يبني 10. تتكرر بإذن من السيفير.
الشكل 5 : (أ) جهاز نموذج للثقافة mechanostimulatory 2D. استخدام صبغة حمراء للاحتفال التسليم الضغط التي تحرك القنوات ، وصبغ اللون الأزرق الذي يستخدم في تحديد القنوات التشحيم. (ب) صورة عينة من سلالة التجربة التوصيف. بقع حمراء تمثل الموقع undeformed من الخرز ، بينما البقع الخضراء تمثل مواقع مشوهة 7. تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
الشكل 6 (أ) جهاز نموذج للتجارب الضغط 3D. استخدام صبغة خضراء للاحتفال قنوات الضغط يشتغل. (ب) من أعلى إلى أسفل عرض مجموعة من micropost مع (ج) بناء نمط a هيدروجيل على رأس آخر. (D ، E) الصور الجانبية بناؤها من الخرز الفلورسنت في بناء هيدروجيل تحت (D) والباقي (E) الضغوط يشتغل 55 كيلو ، مما يدل على عملية توصيف السلالات في نظام الثقافة 3D 10. تتكرر بإذن من السيفير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
رغم بسيطة من الناحية النظرية ، تصنيع الجهاز يستغرق بعض المهارة والممارسة التجريبية. لا سيما في حالة من خلية ثقافة 2D ، يمكن المواءمة بين طبقات متعددة في الجهاز يمكن أن يكون تحديا ، وخصوصا عبر مجموعة واسعة المجال. تحدث عمليا ، لا يمكن أن نحقق نجاحا محاذاة موثوق 100 ٪ معدل استخدام أجهزة مع 50 ميكرومتر التسامح في التباعد بين ميزات المجاورة في طبقات متعددة. لدينا أيضا أثبتت بنجاح المواءمة مع التحمل منخفضة تصل إلى 15 ميكرون ، ولكن في الوقت المطلوب هو التوافق وأكبر بكثير من التي تحققت في خفض معدل النجاح. محاذاة قناع لالحيوية photopattern على الصفيف هو التحدي بالمثل ، ولكن يمكن أن تكون مصممة لتكون وظيفة كبيرة جدا بالمقارنة مع اسطوانات هيدروجيل ، والتخفيف من هذا القيد.
تحديات أخرى تنطوي على زراعة الخلايا على المواد المذكورة في هذا البروتوكول. في نظام 2D تمتد ، وذلك باستخدام PDMS كفيلم حدود الثقافة التحقيق البيولوجية لتجارب قصيرة الأجل ، والتصاق الخلايا لتبدأ الركيزة أن تتأثر بدرجة كبيرة بعد 6 ساعات من التحفيز. ويمكن تصحيح هذا عن طريق تساهميا البروتينات المصفوفة ملزمة لسطح PDMS 11 ، أو عن طريق استبدال زراعة الخلايا PDMS الركيزة بمادة البولي يوريثين أكثر سريريا ذات الصلة ، من أجل تحسين التصاق الخلية وتوفير قدر أكبر من المرونة في التجارب البيولوجية التي أجريت 12. في نظام 3D وصفها ، والمقصود الكيمياء هيدروجيل كمثال توضيحي فقط. على المدى الطويل ثقافة الخلايا الملتصقة يتطلب استخدام بديل الهلاميات المائية الطبيعية أو الاصطناعية ، أو إدراج يغاندس لاصقة في مصفوفة PEG (والذي يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام كيمياء PEGylation القياسية) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نعترف الدعم المالي من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CHRPJ 323533-06) ، ومنحة دراسات عليا لبرنامج CM أونتاريو ، وكراسي البحث كندا في الدقيقة ونظم نانو الهندسة لYS ، وMechanobiology الى محكمة التحكيم الرياضية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit | Dow Corning | ||
| SU-8 masters | |||
| Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | United Chemical Technologies | ||
| Foam pads | Craft supply stores, 1-2 mm thick | ||
| Overhead inkjet transparencies | Grand Toy | ||
| Plexiglass plates | |||
| C-clamp | hardware store | ||
| Micromanipulator system | Siskiyou, Inc. | ||
| Custom-made vaccum mount | |||
| Vision system, Navitar 12x zoom | Navitar | ||
| Connecting tubes | VWR international | Clay Adam Intramedic PE190 | |
| Blunt 18G needles | Small Parts (www.smallparts.com) | ||
| Eccentric diaphragm micropump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | |
| Solenoid valves | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Function generator | |||
| 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | ||
| Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa | Laysan Bio Inc. | ||
| Polyethylene glycol 8 kDa | Sigma-Aldrich | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | ||
| 1-vinyl-2-pyrolidinone | Sigma-Aldrich | ||
| Standard cell culture reagents |
References
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
- Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
- Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
- Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
- Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
- Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).
