Summary
Используя спектрально решен двухфотонной микроскопии изображений системы, на уровне пикселей карты Ферстер Резонансная переноса энергии (FRET) эффективности получены для клеток, экспрессирующих рецепторы мембраны гипотеза о форме гомо-олигомерных комплексов. С FRET эффективность карты, мы можем оценить стехиометрических информацию о олигомер комплекс в стадии изучения.
Abstract
Изучение белковых взаимодействий в живых клетках является важной областью исследований, поскольку информация, накопленная как преимущества, так промышленных приложений, а также увеличивает основные фундаментальные биологические знания. Ферстер (флуоресценция) Резонансное переноса энергии (FRET) между донором молекулы в электронно-возбужденное состояние и близлежащие молекулы акцептора неоднократно использовались для изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Белков, представляющих интерес, помеченные двух различных типов флуоресцентных зондов и выразил в биологических клетках. Флуоресцентных зондов возбуждаются, обычно с помощью лазерного излучения, и спектральные свойства флуоресценции выбросов, исходящих из флуоресцентных зондов собираются и анализируются. Информация о степени белковых взаимодействий встроен в спектральных данных о выбросах. Как правило, ячейки должны быть отсканированы количество раз для того, чтобы накопить достаточно спектральной информации точно количественно степень белковых взаимодействий для каждого региона интересов внутри клетки. Тем не менее, молекулярный состав этих регионах может измениться в ходе процесса приобретения, ограничивая пространственного определения количественных значений очевидно FRET эффективность в среднем по всей клетки. С помощью спектрально решен двухфотонного микроскопа, мы имеем возможность получить полный набор спектрально решен изображений после одной полной проверки возбуждения образца интересов. От этого на уровне пикселей спектральные данные, карту FRET эффективность всей клетке рассчитывается. Применяя простой теории FRET в олигомерных комплексов экспериментально полученные распределения FRET эффективности по всей клетке, одну спектрально решен сканирование показывает стехиометрических и структурную информацию о олигомер комплекс в стадии изучения. Здесь мы опишем порядок подготовки биологических клеток (CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces), выражающая мембранных рецепторов (стерильные 2 α-фактора рецепторов) с меткой двух различных типов флуоресцентных зондов. Кроме того, мы показываем критические факторы, связанные со сбором данных с помощью флуоресценции спектрально решен двухфотонной микроскопии изображений системы. Использование этого протокола может быть продлен для изучения любого типа белка, который может быть выражен в живой клетке с флуоресцентным маркером прилагается к нему.
Protocol
1. Плазмиды дизайн
Белки интерес слиты в одну из двух различных флуоресцентных меток, как описано далее. Флуоресцентные метки не только предоставлять информацию о месте нахождения белков внутри клетки, но и количественную информацию о гомо-олигомеризации белка 1. Техника флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) 2-4 используется для накопления информации о белковых взаимодействий 5-10. FRET использует принцип, что передача энергии может происходить из оптически возбужденных молекул (как правило, называют донором, D) в невозбужденном молекулы (как правило, называют акцепторными,) через диполь-дипольных взаимодействий 11, если две молекулы приходят в непосредственной близости друг к другу. При разработке плазмид кодирование белков слияния, два ключевых особенностей следует иметь в виду, следующим образом.
- Выбор согласованная пара флуоресцентных меток имеет первостепенное значение в FRET исследований. В идеале, люминесцентная комбинация тег должен отвечать двум критериям: заметное перекрытие в длинах волн между спектр излучения донора теги и спектр возбуждения акцептора метку, и большое расстояние между центром длины волны спектра лазерного импульса и спектра возбуждения акцептора (т. е. больших сдвиг Стокса). Два варианта зеленый флуоресцентный белок 12, 13 особенно хорошо подходят для выполнения этих критериев: 2 GFP в качестве донора 14 и желтый флуоресцентный белок (YFP) 12 или вариант его называли Венеру 15, как акцептором. Лазурная 16 можно также использовать в качестве донора, хотя и с несколько более скромные результаты.
- В количественном FRET изображений лучше всего, если только один донор в молекулярный комплекс возбуждается на время (в среднем), так что нет конкуренции происходит между донорами для передачи энергии к тому же акцептором в комплексы, которые содержат более одного донора и одного акцептора . Это приводит к упрощениям в теории и анализ данных процесса 17. Из-за этого, уровень сигнала, как правило, низка. Чтобы компенсировать это, уровень экспрессии белков интересов должны быть относительно высокой. Высокий уровень выражения достигается за счет использования высоких копии плазмиды нести ген белка в клетке.
2. Дрожжи преобразования
Это выгодно, чтобы максимизировать процент популяции клеток выражения белка конструкций, представляющих интерес. Для этого мы преобразуем ауксотрофных штамм дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE), не в состоянии производить триптофан или урацил, с двумя различными плазмидами, одна из которых содержит триптофан выбору маркера и один маркер урацил. Плазмиды также содержат гены, которые несут инструкции по ячейке, чтобы выразить белок с меткой одной из двух флуоресцентных зондов. Трансформированные клетки, выращенные на твердые пластины среде, которая также не хватает триптофана и урацил. По крайней мере, трех типов клеток должны быть преобразованы: клеток, экспрессирующих белки интерес с меткой обоих типов флуоресцентных зондов, клеток, экспрессирующих только белки с меткой доноров флуоресцентных зондов и клеток, экспрессирующих только белки с меткой акцептором флуоресцентных зондов.
- Подготовка твердые пластины средней (1,7 г / л дрожжевого азотистого основания без аминокислот, 1,6 г / л дрожжевого синтетических отсева среда без урацила и триптофана, 2% [/ об] глюкозы, 2% [/ об] агар) для использования в качестве питательной среды для трансформированных клеток по меньшей мере за один день до клеточной трансформации. Твердые пластины среда может быть использована в течение двух месяцев после подготовки, если они останутся без каких-либо загрязнений.
- Для каждой пары плазмиды должны быть преобразованы, добавить 10 мл YPD (10 г / л Бакто дрожжевого экстракта, 20 г / л Бакто пептон, и 2% [/ об] глюкозы) в колбу Эрленмейера. Incoluate YPD с колонией ауксотрофных штамма дрожжевых клеток для преобразования.
- Место колбу Эрленмейера содержащие дрожжи культуры в лабораторный шейкер, который обеспечивает орбитальной закрученного действия на образцах, и инкубировать в течение ночи при 30 ° С. На следующее утро начать мониторинг роста клеточной культуры периодически удаляя малого объема культуры и тестирование ее оптической плотности (ОП). Рост клеточной культуры должны быть в середине логарифмической фазы, т.е. ОП 0,5-1,0, во время преобразования.
- Депозит 5 мкл обоих типов плазмид в стерильную пробирку микроцентрифужных для каждой плазмиды пары должны быть преобразованы.
- Для каждой пары плазмиды должны быть преобразованы, добавляют 5 мкл ДНК спермы лосося (5 мг / мл) в пустую трубку микроцентрифужных. Погрузите нижнюю половину микроцентрифужных трубки, содержащей ДНК спермы лосося в кипящую воду на пять минут. Для предотвращения шапка микроцентрифужных трубку от выскакивают опан, только погрузить нижнюю часть микроцентрифужных труб в воду. Сняв с кипящей водой, места микроцентрифужных трубку с ДНК спермы лосося во льду в течение не менее двух минут.
- Добавьте 5 мкл ДНК спермы лосося каждому микроцентрифужных трубки, содержащей плазмиды.
- Мера ОП растущей культуры дрожжей, чтобы подтвердить, что он достиг середины логарифмической фазы (т.е. ОД читать между 0,5 и 1,0).
- Центрифуга дрожжевой суспензии в 1000xg течение двух минут.
- Слейте надосадочную и ресуспендируйте дрожжей гранул в стерилизованные деионизированной воды с использованием вихревой смеситель.
- Центрифуга подвески еще раз на 1000xg течение двух минут.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в растворе 0,1 М LiOAc в TE (1,02 г LiAc, 10 мл 1М Трис при рН 7,4, и 10 мл 0,1 М ЭДТА при рН 8,0). Объем 0,1 LiOAc в ТЕ должна быть равна 1 / 100-го первоначального объема культуры дрожжей в YPD.
- Распределить 100 мкл клеток к каждому из микроцентрифужных пробирки, содержащие плазмиды. Флик каждую пробирку осторожно, чтобы смесь клеток с плазмид.
- Добавить 400 мкл 44% [/ об] полиэтиленгликоля (ПЭГ 4000) решение для каждого из микроцентрифужных труб.
- Аккуратно перемешайте ПЭГ 4000 с клетками и плазмиды. Для того, чтобы избежать нарушения клетки, не используйте вихревой смеситель в этой точке. Чтобы хорошо смешайте, держите крышку микроцентрифужных и нижней части микроцентрифужных трубки между указательным и большим пальцами, медленно инвертировать трубки, а затем медленно довести трубку обратно в вертикальное положение. Поворот трубки 90 ° вокруг своей оси цилиндрических и медленно инвертировать еще раз. Повторите эту процедуру несколько раз, так что клетки скатиться всей поверхности стен микроцентрифужных трубки.
- Место микроцентрифужных труб в 30 ° инкубаторе в течение 45 минут.
- После 45 минут инкубации, удалите клетки из инкубатора и повторить нежный смешивания процедуре, описанной в 14.
- Место микроцентрифужных труб в 42 ° водяную баню и выдержать в течение 15 минут. Еще раз, только погрузить нижнюю часть микроцентрифужных труб в воду.
- После инкубации 42 °, добавить 1 мл стерилизованного деионизированной воды микроцентрифужных труб.
- Центрифуга труб в настольный микроцентрифужную течение 5 секунд. Удалить супернатант из труб использованием micropipetter.
- Добавить 100 мкл стерилизованной деионизированной воды к каждому из микроцентрифужных труб и смешать стерилизовать деионизированной воды с клетки, используя процесс инверсии.
- Добавить содержимое одной пробирки микроцентрифужных к пластине ростовой среды, который выбирает для конкретного плазмид добавил к этому микроцентрифужных трубки. Добавить 4-6 стерилизованные стеклянные бусы (1 мм в диаметре). Встряхните пластину, содержащую капли превращаются дрожжевых клеток и стеклянные бусы для того, чтобы клетки распространяются по поверхности питательной среде агара. Повторите эту процедуру для каждого набора трансформированных клеток.
- Место плит в 30 ° инкубаторе в течение 3 - 5 дней. После 3-5 дней, несколько колоний дрожжей 1-3 мм в диаметре будут видны на поверхности питательной среды. В это время клетки готовы для включения в образ в спектрально решен двухфотонного микроскопа.
3. Калибровка спектрально решен двухфотонного микроскопа
Спектрально решен двухфотонного микроскопа, используемые в этих исследованиях были подробно описаны в других 18, 19. Короче говоря, мощных твердотельных лазер непрерывного излучения используется для насоса с синхронизацией мод Ti: Sapphire лазера, генерирующего фемтосекундных импульсов длин волн в диапазоне от ~ 750 до 830 нм. Лазерный луч фокусируется высококачественного микроскопа Н. А. целью дифракционного пятна на образце. Возбуждение происходит только в ближайшем фокальной области пучка из-за низкой вероятности двухфотонного возбуждения. Пару ортогональных с компьютерным управлением зеркала сканирования используются для перевода в центре пучка в плоскости образца в двух разных направлениях (именуемые направлениях х и у всей протокол). Резервное распространяющихся флуоресценцию излучением освещенные воксела образца разгоняется на спектральные компоненты передачи решеткой помещается в пути выбросов, прежде чем свет падает на инцидент пикселей EM-ПЗС-матрицы. Таким образом, полный спектральный профиля любой флуоресцентные молекулы / молекул в фокальной области пучка получается по одному измерению (у направлении) ПЗС-матрицы. Использование часть одного из двух зеркал сканирования, расположение лазерного фокуса могут быть отсканированы в образце вдоль линии, перпендикулярной направлению у. Поддерживая затвора ПЗС-камеры открытым в течение этого одного сканирования линии, спектральные профили флуоресцентных молекул разрешениемiding вдоль всей линии сканирования, собранных в одном развертки лазерного луча на образце. Накопление несколько процессов сканирования линии такого рода в разных местах у внутри клетки дает спектральные профили большого числа флуоресцентных комплексов, проживающих в пределах образца. Изображения, полученные от линии сканирования реконструируются, чтобы дать несколько ху интенсивность флуоресценции пространственные карты образца при различных длинах волн 18, 19. Для того, чтобы точно реконструировать и расчета фактической длины волны, соответствующей ху флуоресцентные интенсивность пространственной карты, протокол строчной развертки должен быть откалиброван с использованием выборки с хорошо характеризуется флуоресценции спектра излучения.
- Спектрально решен двухфотонного микроскопа накапливается спектральной информации о олигомерных комплексов в отображаемого ячейки путем сканирования фокус возбуждения пучка по выборке заинтересованность в ряде мест.
- Пару ортогональных сканирования зеркала используется для перевода фокуса лазерного луча на образце в двух разных направлениях. Движение сканирования зеркал с компьютерным управлением и синхронизируется с извлечением данных флуоресценции от интенсивности ПЗС-камерой.
- С линии сканирования, интенсивность флуоресцентного пространственной карты соответствует определенной длине волны света может быть реконструирован. Для того, чтобы точно реконструировать ху флуоресцентные интенсивность пространственной карты и расчета фактической длины волны, соответствующей каждой из этих карт, протокол строчной развертки должен быть откалиброван использованием флуоресцеина решение.
- Для начала процедуры калибровки, центр возбуждения спектра на длине волны 800 нм, что 2X максимальная длина волны возбуждения донора теги, GFP 2. Расстояние до центра спектра возбуждения, переводить призма расположена в резонаторе лазера для изменения дисперсии групповой скорости. Призма установлена на компьютере контролируемой линейной моторизованных этапе.
- Использование компьютерной программы камеры сопряжено с, отправить команду на ПЗС-матрицу, чтобы понизить температуру ПЗС-матрицы до самой низкой достижимой температуры, чтобы уменьшить темные шума.
- Внесите 10 мкл раствора флуоресцеина на предметное стекло. Крышка с покровным так, что тонкий слой образца равномерно рассеяны в области между покровное и предметное стекло.
- Место небольшую каплю иммерсионного масла на поверхности покровного
- Теперь закрепите стекло микроскопа на сцену перевод хуг и перевод слайдов / сцена в оптическом направлении оси на ручную линейный привод, который контролирует сценическое движение в направлении оптических осей. Перевести слайд / этапа до объектива микроскопа входит в контакт с каплю иммерсионного масла.
- Использование компьютерной программы, которая управляет камерой, переключитесь в режим видео сбора данных так испускаемого света, падающего на ПЗС-матрицы отображается на экране компьютера в реальном времени. Медленно, настроить микрометра контрольный перевод этапом в направлении оси оптических принести образец в фокусного пятна лазерного луча.
- Когда образец флуоресцеина находится в фокусе, эмиссия будет выглядеть как резкие линии на ПЗС-матрицы. Скачать считывание интенсивности пикселов с ПЗС-матрицы к компьютеру с помощью компьютерной программы управления камерой. Мера интенсивности пикселей в зависимости от положения на ПЗС-матрицы, открыв скачанный матрица значений интенсивности в изображения J и рисования линии, проходящей через флуоресцентные регионе. Используйте команду Изображение J Анализ → Участок профиля создать сюжет иллюстрирует спектр излучения образца флуоресцеина.
- Настройка дополнительных параметров зеркало, которое контролирует движение лазерного фокуса в направлении у, такой, что соседние позиции у внутри образца приводит к движению пик флуоресценции ровно на один пиксел по спектральной размерностью на ПЗС массиве. Монитор это, загрузив интенсивности флуоресцеина спектров значение изображения для двух разных позициях у включенных в выборку, открывая интенсивность изображения с изображения J, и находя положение пика пикселей для каждого из спектров флуоресценции с помощью курсора изображение J.
- Оставив затвора ПЗС открытым, сканирования лазерного фокуса на образце в направлении х. Света, излучаемого каждым воксела вдоль линии сканирования должна опускаться падающего на ПЗС-матрицы.
- Хранить данные из ПЗС-матрицы, полученные для этой линии сканирования и снимите пикселей ПЗС-матрицы.
- Перемещение положение лазерного фокуса в направлении у на суммы, определенной в пункте 11 настоящего раздела.
- Сканирование лазерным лучом в направлении х на образце, снова оставляя открытым затвором ПЗС-арлучей и хранения данных.
- Повторите эту процедуру строчной развертки до физического площадью ~ 50% больше, чем размеры одной биологической клетке был освещен светом лазера.
- Отношения между номер строки конкретное изображение линии сканирования и длина волны должна быть использована для восстановления изображений для получения нескольких ху флуоресцентные интенсивность пространственной карты на разных длинах волн. Чтобы получить излучение ху флуоресценции изображение для определенной длины волны (λ к), найти номер строки на изображение, полученное от первого сканирования линии, которая соответствует этой длине волны. Затем смежных ряда последующих разверткой линия соответствует следующий ряд флуоресценции изображение выбросов для конкретной длины волны. Сложите все изображения строк, которые соответствуют этой длине волны для получения ху флуоресцентные интенсивность пространственной карты образца при этой длине волны. Повторите эту процедуру для всех остальных получить длин волн.
- Чтобы вычислить длину волны, связанные с каждым ху флуоресцентные интенсивности пространственных карте, определить фоне исправлены нормированные интенсивности флуоресценции каждого восстановленного изображения в зависимости от изображения индекс (к). Отношения между камерой позиции в спектральном измерении и длина волны излучаемого фотона близка к линейной, поэтому отношения между реконструированы ху флуоресцентные интенсивности пространственных изображений карт и соответствующей длине волны также линейных и рассчитывается следующим образом:
где значение т представлена: 
В приведенном выше формализма, символ λ J представляет длину волны й у восстановленного изображения. Значения λ макс и λ ½ извлекаются из спектра излучения образца флуоресцеина и соответствуют длинам волн, при котором интенсивность флуоресценции флуоресцирующих образец максимальной и половине максимальной, соответственно. Изображение индексы у Макса и у ½ соответствуют восстановленных изображений обладающие максимальной интенсивности флуоресценции и половину максимальной, соответственно.
где значение т представлена: 
4. Сбор данных о биологических образцов интерес
- Для сбора данных по вашим образцам, сначала удалите из инкубатора пластин с преобразованным колоний дрожжей. Там должно быть по крайней мере три типа трансформированных клеток полной ширины полувысоте (FWHM):
- клеток, экспрессирующих белки интерес с меткой обоих типов флуоресцентных зондов
- клеток, экспрессирующих только белки с меткой доноров флуоресцентных зондов, а также
- клеток, экспрессирующих только белки с меткой акцептором флуоресцентных зондов.
- Добавить 100 мкл 100 мМ KCl, чтобы микроцентрифужных трубки. Использование кончика микропипетки, очистите 3-5 колоний дрожжей от пластины клеток, экспрессирующих белки помеченные как доноров, так и акцептора флуоресцентных зондов, а также привить 100 мМ KCl с этих клеток.
- Удалить 10 мкл клеточной суспензии и обойтись без его на свежий микроскопический слайд, крышка капли с покровным и поместите каплю масла на поверхности покровного стекла.
- Вручную закрыть затвор на пути лазерного луча в блок лазерного света от достижения объектива микроскопа.
- Закрепите стекло микроскопа на сцену перевод хуг и перевод слайдов / сцена в оптическом направлении оси до объектива микроскопа входит в контакт с каплю иммерсионного масла.
- Широкое поле изображения образца будет существенно размыта из-за наличия передачи решетки в выбросах пути. Поэтому место полосовой фильтр с небольшим FWHM в оптическом тракте предыдущие передачи решетки. Включите широкого освещения светового поля, и перейти в режим видеокамеры сбора данных. Медленно переводить перевод этап в оптическом направлении оси во время просмотра изображений клеток на экране камеры, пока клетки сфокусировать
- Перевести этап в любом х или направлению у в целях приведения одной клетки к месту фокусе лазерного луча.
- Выключите широкий источник освещения поля. Удалить полосовой фильтр от выбросов путем.
- Разблокировать лазерный луч на короткое время (<1 секунды), при одновременном просмотре сигнала, полученного на ПЗС-матрицы. Если флуоресцентный сигнал обнаружен на ПЗС-матрицы во время лазерного луча, падающего на ячейку, а затем выполните полную флуоресценции сбора данных сканирования этой клетки. Очень важно использовать те же параметры сканирования, в частности, количество строк и у прирост, как это определено в оклибрации процедуре показано ранее.
- Повторите расположение клеток и флуоресценция процесс сбора данных для большого числа клеток, экспрессирующих белки придается как доноров, так и акцептора теги теги.
- После накопления флуоресцентные изображения клеток, экспрессирующих белки помеченные как рецепторы, повторите весь процесс для обеих клеток, экспрессирующих только белки с меткой доноров флуоресцентных зондов и клеток, экспрессирующих только белки с меткой акцептором флуоресцентных зондов.
- Использование процедуры, описанной в разделе 3, реконструировать все сканирования для получения спектрально решен ху флуоресцентные интенсивность пространственной карты для каждого набора данных.
5. Анализ изображений
Каждый пиксель ху интенсивность флуоресцентного пространственные карты, которые являются результатом сканировании одного из флуоресцирующих биологическая клетка, содержит полный спектральный профиль молекулярного комплекса, проживающих в возбуждении воксела соответствующего данной пиксель. Если белков, представляющих интерес, взаимодействующих друг с другом, эта спектральная профиль будет содержать смесь сигналов от обоих донора и акцептора флуоресцентных зондов. Для того чтобы определить характер взаимодействия между белками интерес, спектральных профилей из большого числа этих белковых комплексов в клетке должны быть отобраны и очевидной FRET эффективности (Е приложение), определяемый как доля возбужденных состояний донорской флуоресцентного зонда, которые становятся переданы акцептором флуоресцентного зонда через FRET, каждого пикселя должны быть рассчитаны.
- Определите фоне коррекции интенсивности флуоресценции для каждой из восстановленных изображений, описанных в разделе 4 для клеток, экспрессирующих белки с меткой только донор флуоресцентных зондов и нормализовать до максимального значения. Потому что каждый из этих восстановленных изображений соответствует отдельный длин волн (λ к) этой коллекции нормированной флуоресценции значения интенсивности соответствует измеряется спектр излучения донора зонды, я D (λ J).
- Повторите шаг 1 для клеток, экспрессирующих белки с меткой только акцептором флуоресцентные метки для получения измеряется спектр излучения акцептором зонды, я (λ J). Так как акцепторные зонд выбрана так, что он редко прямо возбужденным использованием лазерного источника, сигнала, исходящих из акцепторного только образцы будут низкими и, возможно, того же порядка величины, что клетки присуще аутофлюоресценция сигнала. Таким образом, измеряется спектр флуоресценции акцептора рассчитаны таким образом, возможно, должны быть исправлены, чтобы удалить вклад аутофлюоресценция прежде чем продолжить.
- Использование нормированный спектр, полученный на шаге 1, и в шаге 2, спектрально разложить каждый пиксель флуоресценции спектр излучения клеток, экспрессирующих оба белка с меткой доноров флуоресцентных зондов и белков с меткой акцептором флуоресцентных зондов с помощью соотношения I (λ к) = к Д. А. я D (λ к) + к AD я (λ к), где I (λ к) представляет каждого конкретного пикселя измеренный спектр флуоресценции. Значениях к Д. А. и к AD пропорциональны флуоресценции выбросов от доноров в присутствии акцепторов и от акцепторов в присутствии доноров, соответственно, 5.
- Рассчитать очевидным FRET эффективность, которая отображает взаимодействие белков в клетке в каждом пикселе по формуле,
. Здесь Q D и Q являются квантовые выходы донора флуоресцентного зонда и акцептора флуоресцентного зонда соответственно, и без D и W являются интегралы нормированы донора и акцептора спектр излучения, соответственно, 19, 20. - Наконец, создайте гистограммы использованием расчетных значений E приложение для каждого пикселя, где количество раз конкретное значение приложение E происходит, является заговор против данного значения Е приложения.
. Здесь Q D и Q являются квантовые выходы донора флуоресцентного зонда и акцептора флуоресцентного зонда соответственно, и без D и W являются интегралы нормированы донора и акцептора спектр излучения, соответственно, 19, 20. 6. Гистограмма Анализ
Для того чтобы извлечь количественную информацию из приложения E гистограмм, каждая гистограмма теоретически подходят с суммой гауссовых функций, в соответствии со следующей формулой: 
,
где я это амплитуда, σ я стандартное отклонение и E 0i наиболее вероятных FRET эффективность я й гауссовой функции. Различные размеры олигомеров и конфигураций, приводят к различным числом (п) 0i E и различных соотношений между ними 1, 17. Например, для ромбовидных тетрамер, пять пиков по прогнозам, данное выражение, перечисленных в таблице 1.
Таблица 1. Отношения между каждым из пяти значений гауссовский пик центр и попарно FRET эффективности прогнозируется ромб форме тетрамера. 
Это означает, что только один E 0i значение должно быть скорректированы в процессе установки данных - один, соответствующий E р - в то время как остальные четыре вычисляются значения Е р.
- Предположим, олигомер модель и определить число Гаусса, который будет использоваться в оснащении E приложение гистограммы 1. Fit гистограммы, регулируя Е р, я, я и σ. Обратите внимание, что относительное расположение гистограммы фиксируется модели. Свернуть хи-квадрат из соответствовать или другого добра, согласия, функциональный.
- Предположим, другой вероятной моделью олигомеров и повторите шаг номер 1.
- Выберите модель, которая наилучшим образом соответствует данных для множества параметров, используемых. , Которые могут потребовать использования статистических тестов (таких как хи-квадрат на число степеней свободы).
Представитель Результаты
Иллюстрированный на рисунке 1, результирующая к Д. А., к нашей эры, и приложение E пространственной карты вычисляется из спектрально решен двухфотонной микроскопии измерений, выполненных на дрожжевых клеток выражения Стерильные 2 α-фактора (Ste2p) 21, 22.
Рисунок 1. Дрожжевая клетка выражения стерильные 2 α-фактора рецепторов. Двумерные карты донора (к DA) и акцепторных (к н.э.) сигналы были получены спектральные процедура деконволюции применяется к каждому пикселю расположение изображения, сделанные с использованием спектрально решен двухфотонного микроскопа дрожжевой клетки выразив стерильные 2 α-фактора рецепторов (Ste2p). Интенсивности флуоресценции назначаются ложные цвета в зависимости от их значения и масштаба отображается в виде вставки. Двумерные карты очевидны ладу эффективности были рассчитаны с использованием DA к а к AD изображений.
Гистограмма заговор был подготовлен с использованием значения, извлеченные из карты E приложение ячейки показано на рисунке 1. Изображенный на рисунке 2, оборудован участок гистограммы, соответствующие измеренным E приложения значения (кружки) ячейки, изображенные на рисунке 1. Красная сплошная линия лучше всего подходят для измерений с использованием суммы отдельных функций Гаусса (зеленая сплошная линия).
Рисунок 2. Гистограмма сюжет E приложения значения для дрожжевых клеток выражения Стерильные 2 α-фактора рецепторов. Гистограмма участка, которая соответствует измеренных значений (круги) приложение Е, для ячейки изображенный на рисунке 1 показана. Индивидуальные функции Гаусса (твердые зеленые линии) суммируются для моделирования (сплошная красная линия) измеренных значений. Параметров гауссовой функции являются: Е 01 = 16,7; 1 = 118,9; σ 1 = 3,2; E 02 = 25,1; 2 = 100,0; σ 2 = 4,6; E 03 = 32,6; 3 = 202,6; σ 3 = 4.6; E 04 = 40,1; 4 = 92,6; σ 4 = 3.7; E 05 = 50,1; 5 = 16,0; σ 5 = 7,9.
Отношения между гауссовским средств, необходимых для соответствия данных, представленных в гистограмме на рис 2 приведены в таблице 1. Количество и соотношение между гауссовых функций соответствует количеству и корреляций между ожидаемыми E приложения значения для формы ромба комплексов олигомер тетрамер. Таким образом, становится очевидным, спектрально решен двухфотонного измерений, что комплекс Ste2p олигомер принимает форму ромба форме тетрамера в естественных условиях 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой презентации мы показали, как определить размер и структурную информацию о белковый комплекс олигомерных в естественных условиях. Хотя данные, представленные была получена из специфическим рецептором мембраны (т.е. Ste2p), выраженные в дрожжевые клетки, этот метод является всеохватывающим, что оно может быть применено к любому типу белок, выраженные в любой тип клеток, единственным условием в том, что белки помечены с соответствующими флуоресцентными маркерами. Будущие модификации данного протокола будет включать в себя повышение инструментом для достижения более высоких скоростях сканирования в попытке контролировать зависящие от времени белок размером олигомера и структурные изменения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана UW-Милуоки исследований роста инициативы, Висконсин Институт медико-биологических и медицинских технологий, а также Фонда Брэдли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , Springer. London. (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J.
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
