En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

Summary

Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.

Abstract

El estudio de las interacciones de proteínas en células vivas es un área importante de investigación debido a que la información acumulada tanto en las aplicaciones de los beneficios industriales, así como aumenta el conocimiento básico biológico fundamental. Förster (fluorescencia) la transferencia de energía por resonancia (FRET) entre una molécula de donantes en un estado electrónicamente excitado y una molécula de receptor de cerca ha sido frecuentemente utilizado para el estudio de las interacciones proteína-proteína en las células vivas. Las proteínas de interés se marcan con dos tipos diferentes de sondas fluorescentes y se expresa en las células biológicas. Las sondas fluorescentes son entonces emocionado, por lo general usando luz láser, y las propiedades espectrales de la emisión de fluorescencia que emanan de las sondas fluorescentes se recopila y analiza. La información sobre el grado de las interacciones proteína está incrustado en los datos de emisión espectral. Por lo general, la célula debe ser analizado un número de veces que el fin de acumular suficiente información espectral para cuantificar con exactitud el alcance de las interacciones de proteínas por cada región de interés dentro de la célula. Sin embargo, la composición molecular de estas regiones pueden cambiar durante el curso del proceso de adquisición, lo que limita la determinación espacial de los valores cuantitativos de la aparente eficiencia de FRET a un promedio de células enteras. Por medio de un espectro resuelto de dos fotones microscopio, podemos obtener un conjunto completo de imágenes espectral resuelto después de sólo un ciclo de excitación completa de la muestra de interés. De estos datos espectrales a nivel de píxeles, un mapa de FRET eficiencia a través de la celda se calcula. Mediante la aplicación de una teoría simple de FRET en los complejos oligoméricos a la distribución obtenidos experimentalmente la eficiencia de FRET en toda la célula, una sola exploración espectral resuelto revela información estequiométrica y estructural sobre el complejo oligómero en estudio. A continuación se describe el procedimiento de preparación de las células biológicas (la levadura Saccharomyces cerevisiae) que expresan receptores de membrana (estéril factor 2 α-receptores) marcado con dos tipos diferentes de sondas fluorescentes. Además, ilustran los factores críticos de la recogida de los datos de fluorescencia utilizando el espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía. El uso de este protocolo podrá ser extendido a estudiar cualquier tipo de proteína que puede ser expresado en una célula viva con un marcador fluorescente que se le atribuye.

Protocol

1. Diseño plásmido

Las proteínas de interés se fusionan en uno de dos marcadores fluorescentes diferentes, como se describe a continuación. Las etiquetas fluorescentes no sólo proporcionan información sobre la localización de las proteínas dentro de la célula, sino también información cuantitativa respecto a la homo-oligomerización de la proteína ^1. La técnica de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) ^2-4 es usado para acumular la información sobre las interacciones de proteínas ^50-10. FRET utiliza el principio de que una transferencia de energía se puede producir a partir de una molécula ópticamente excitado (normalmente se conoce como el donante, D) a una molécula de no excitado (normalmente se conoce como aceptor, A) a través de interacciones dipolo-dipolo ^11, si las dos moléculas vienen muy cerca uno del otro. En el diseño de los plásmidos que codifican las proteínas de fusión, dos características fundamentales deberían tenerse en cuenta, de la siguiente manera.

1. Selección de una pareja compatible de etiquetas fluorescentes es de suma importancia en los estudios de FRET. Idealmente, la combinación de etiqueta fluorescente debe cumplir dos criterios: una superposición apreciable en longitudes de onda entre el espectro de emisión de la etiqueta de los donantes y el espectro de excitación de la etiqueta del aceptante, y una gran separación entre la longitud de onda central del espectro del pulso láser y el espectro de excitación del aceptante (es decir, desplazamiento de Stokes grande). Dos variantes de la proteína verde fluorescente ^{12, 13} son especialmente adecuados para cumplir con los siguientes criterios: la GFP ₂ como donantes ¹⁴ y la proteína fluorescente amarilla (YFP) ¹² o una variante de la llamada Venus ¹⁵ como receptor. Cerulean ¹⁶ también podría ser utilizado como un donante, aunque con resultados algo más modesto.
2. En términos cuantitativos FRET imagen es mejor que si sólo uno de los donantes en un complejo molecular está emocionado a la vez (en promedio), por lo que no ocurre la competencia entre los donantes para la transferencia de energía al mismo receptor de los complejos que contienen más de un donante y el receptor un . Esto nos lleva a simplificaciones de la teoría y ^{17 de} datos de análisis de procesos. Debido a esto, el nivel de señal es generalmente baja. Para compensar esto, el nivel de expresión de las proteínas de interés debe ser relativamente alta. Altos niveles de expresión se logra mediante el uso de una copia de alta plásmido para llevar el gen de la proteína en la célula.

2. La levadura de transformación

Es ventajoso para maximizar el porcentaje de la población de células que expresan las construcciones de la proteína de interés. Para ello, podemos transformar una cepa auxotróficos de células de levadura (Saccharomyces cerevisiae), incapaz de producir triptófano o uracilo, con dos plásmidos diferentes, uno con el triptófano y un marcador de selección el uracilo marcador. Los plásmidos también contienen los genes que llevan las instrucciones para que la célula expresa la proteína de interés marcados con una de las dos sondas fluorescentes. Las células transformadas se cultivan en placas de medio sólido, que también carecen de triptófano y uracilo. Por lo menos tres tipos de células debe ser transformado: las células que expresan las proteínas de interés marcados con ambos tipos de sondas fluorescentes, las células que expresan proteínas sólo etiquetados con las sondas fluorescentes de los donantes y las células que expresan proteínas sólo etiquetados con las sondas fluorescentes aceptor.

1. Prepare platos medio sólido (1,7 g / L de nitrógeno de la levadura de base w / o aminoácidos, 1,6 g / L de levadura sintética deserción uracilo medio W / O y el triptófano, un 2% [w / v] de glucosa, 2% [w / v] agar) para ser utilizado como medio de crecimiento de las células transformadas por lo menos un día antes de la transformación celular. Las placas de medio sólido se puede utilizar durante un máximo de dos meses después de la preparación si se mantienen libres de cualquier contaminante.
2. Para cada par de plásmido para transformar, agregar 10 ml de YPD (10 g / L extracto de levadura Bacto, 20 g / L de peptona Bacto, y el 2% [w / v] glucosa) a un matraz Erlenmeyer. Incoluate la YPD con una colonia de la cepa auxotróficos de células de levadura que se transforma.
3. Colocar el Erlenmeyer que contiene la levadura de cerveza en un vaso de laboratorio, que ofrece una acción orbital girando en las muestras, y se incuba durante la noche a 30 ° C. A la mañana siguiente, comenzar a monitorear el crecimiento del cultivo de células de forma periódica la eliminación de un pequeño volumen de el cultivo y la densidad óptica (DO). El crecimiento del cultivo celular se debe a mediados de la fase logarítmica, es decir, un diámetro exterior de 0,5 a 1,0, en el momento de la transformación.
4. Depósito de 5 l de los dos tipos de plásmidos en un tubo estéril de microcentrífuga para cada par de plásmido a ser transformados.
5. Para cada par de plásmido para transformar, añadir 5 l de ADN de esperma de salmón (5 mg / ml) a un tubo de microcentrífuga de vacío. Sumerja la mitad inferior del tubo de microcentrífuga que contiene el ADN de esperma de salmón en agua hirviendo durante cinco minutos. Para evitar que la tapa del tubo de microcentrífuga de op estallares, sumergir sólo la mitad inferior de los tubos de microcentrífuga en el agua. Después de la eliminación del agua hirviendo, coloque el tubo de microcentrífuga que contiene el ADN de esperma de salmón en el hielo durante al menos dos minutos.
6. Añadir 5 l de ADN de esperma de salmón a cada tubo de microcentrífuga que contiene plásmidos.
7. Mida el diámetro exterior de la cultura de la levadura de crecimiento para confirmar que ha llegado a mediados de la fase logarítmica (es decir, la lectura de DO entre 0,5 y 1,0).
8. Centrifugar la suspensión de levadura en 1000xg durante dos minutos.
9. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet de levadura en agua esterilizada desionizada utilizando un mezclador vortex.
10. Centrifugar la suspensión una vez más en 1000xg durante dos minutos.
11. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en una solución de 0,1 M LiOAc en TE (1,02 g LiAc, 10 ml de 1 M Tris a pH 7,4, y 10 ml de EDTA 0,1 M a pH 8,0). El volumen de 0,1 M en LiOAc TE debe ser igual a 1 / 100 ^{º aniversario} de la levadura de la cultura volumen original en YPD.
12. Distribución de 100 L de las células de cada uno de los tubos de microcentrífuga que contenían los plásmidos. Flick cada tubo suavemente para mezclar las células con los plásmidos.
13. Añadir 400 l de 44% [w / v] de polietilenglicol (PEG ₄₀₀₀₎ solución a cada uno de los tubos de microcentrífuga.
14. Mezcle suavemente el PEG ₄₀₀₀ con las células y los plásmidos. Con el fin de evitar la ruptura de las células, no utilice un mezclador de vórtice en este momento. Para mezclar suavemente, mantenga la tapa de microcentrífuga y la parte inferior del tubo de microcentrífuga entre el índice y el pulgar, lentamente invertir el tubo, y luego poco a poco llevar el metro de vuelta a la posición vertical. Gire el tubo de 90 ° sobre su eje cilíndrico y poco a poco invertir de nuevo. Repita este proceso varias veces para que las células se deslizan por toda la superficie de las paredes del tubo de microcentrífuga.
15. Coloque los tubos de microcentrífuga en una incubadora a 30 ° durante 45 minutos.
16. Después de 45 minutos de incubación, extraer las células de la incubadora y repita el procedimiento de mezcla suave descrito en 14.
17. Coloque los tubos de microcentrífuga en un baño de agua 42 ° y se incuba durante 15 minutos. Una vez más, sólo se sumerja la mitad inferior de los tubos de microcentrífuga en el agua.
18. Después de la incubación de 42 °, agregar 1 ml de agua esterilizada desionizada a los tubos de microcentrífuga.
19. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga de mesa durante 5 segundos. Eliminar el sobrenadante de los tubos usando una micropipeta.
20. Añadir 100 ml de agua esterilizada desionizada a cada uno de los tubos de microcentrífuga y se mezcla el agua esterilizada desionizada con las células mediante el proceso de inversión.
21. Añadir el contenido de un tubo de microcentrífuga solo a una placa de medio de cultivo que se selecciona para los plásmidos añadido especial de que el tubo de microcentrífuga. Añadir 4-6 perlas de vidrio esterilizado (1 mm de diámetro). Agite la placa que contiene la gota de células de levadura transformadas y cuentas de vidrio a fin de que las células se extienden sobre la superficie del medio de cultivo de agar. Repita este proceso para cada conjunto de células transformadas.
22. Coloque las placas en una incubadora a 30 ° durante 3 - 5 días. Después de 3-5 días, múltiples colonias de levadura de 1-3 mm de diámetro será visible en la superficie del medio de cultivo. En este momento, las células están listos para ser fotografiado en el espectro resolverse de dos fotones microscopio.

3. Calibración del espectro resuelto microscopio de dos fotones

El espectro resuelto microscopio de dos fotones utilizados en estos estudios se ha descrito en detalle en otra parte ^{18, 19.} En resumen, una gran potencia láser de estado sólido de onda continua se utiliza para bombear un modo bloqueado Ti: Zafiro láser que genera pulsos de femtosegundos de longitudes de onda que van desde ~ 750 a 830 nm. El rayo láser es enfocado por un objetivo de microscopio de alto NA a un punto de difracción limitada en la muestra. La excitación sólo se produce en la región cerca de centro de la viga debido a la baja probabilidad de dos fotones de excitación. Un par de espejos de exploración ortogonal controlados por ordenador se utilizan para convertir el centro de la viga en el plano de la muestra en dos direcciones diferentes (en adelante, las direcciones x e y a lo largo de protocolo). La emisión de fluorescencia de respaldo de propagación de un voxel iluminada de la muestra se dispersa en los componentes espectrales de una red de transmisión coloca en el camino de la emisión antes de la luz incidente cae sobre los píxeles de una serie EM-CCD. Así, el perfil completo del espectro de una molécula fluorescente / moléculas dentro de la región central de la viga se obtiene a lo largo de una dimensión (dirección y) de la matriz CCD. Utilizando el movimiento de uno de los dos espejos de exploración, la ubicación del foco de láser se pueden explorar dentro de la muestra a lo largo de una línea perpendicular a la dirección y. Al mantener el obturador de la cámara CCD abierta durante esta exploración sola línea, los perfiles espectrales de la resolución de las moléculas fluorescentesiding a lo largo de toda la línea del análisis se recogen en un solo barrido del haz de láser a través de la muestra. La acumulación de las exploraciones de varias líneas de este tipo en lugares diferentes y dentro de la célula da los perfiles espectrales de un gran número de complejos fluorescentes que residen dentro de la muestra. Las imágenes obtenidas a partir de las líneas de barrido se reconstruyen para dar múltiples mapas xy fluorescencia espacial de la intensidad de la muestra a diferentes longitudes de onda ^{18, 19.} Con el fin de reconstruir con precisión y calcular la longitud de onda real correspondiente a los mapas de intensidad espacial xy fluorescentes, el protocolo de análisis de la línea debe ser calibrado usando una muestra con un espectro de emisión de fluorescencia bien caracterizados.

1. El espectro resuelto microscopio de dos fotones se acumula la información espectral sobre los complejos oligómero en la célula mediante el escaneo de imágenes en el centro de la viga de la excitación a través de la muestra de interés en varios lugares.
2. Un par de espejos de exploración ortogonal se utiliza para traducir el enfoque del rayo láser a través de la muestra en dos direcciones diferentes. El movimiento de los espejos de exploración está controlado por ordenador y sincronizada con la extracción de los datos de intensidad de fluorescencia de la cámara CCD.
3. De los análisis lineales, mapas fluorescentes espacial de la intensidad que corresponde a una determinada longitud de onda de la luz puede ser reconstruido. Con el fin de reconstruir con precisión los mapas xy fluorescentes intensidad espacial y cálculo de la longitud de onda real que corresponde a cada uno de estos mapas, el protocolo de análisis de la línea debe ser calibrado usando la solución de fluoresceína.
4. Para comenzar el procedimiento de calibración, el centro del espectro de excitación a una longitud de onda de 800 nm, lo que equivale a 2 veces la longitud de onda de excitación máxima de la etiqueta de los donantes, las buenas prácticas agrarias _2. Al centro del espectro de excitación, traducir el prisma situado dentro de la cavidad láser para modificar la velocidad de dispersión del grupo. El prisma se monta en un escenario controlado por ordenador lineales motorizados.
5. Utilizando el programa informático de la cámara se conecta al bus, enviar un comando al chip CCD para bajar la temperatura del chip CCD a su temperatura más baja posible para reducir el ruido oscuro.
6. Pipeta de 10 l de solución de fluoresceína en un portaobjetos de microscopio. Cubrir con un cubreobjeto de manera que una capa delgada de la muestra sea uniformemente dispersas en la región entre el cubreobjetos y portaobjetos de microscopio.
7. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la superficie del cubreobjetos
8. Ahora apriete los portaobjetos para la etapa de traducción xyz y traducir la diapositiva / etapa en la dirección del eje óptico por el ajuste manual de los actuadores lineales, que controla el movimiento en el escenario en la dirección del eje óptico. Traducir la diapositiva / etapa hasta que el objetivo del microscopio entra en contacto con la gota de aceite de inmersión.
9. Utilizando el programa informático que controla la cámara, cambiar a un modo de vídeo de adquisición de datos por lo que la luz emitida en huelga el CCD se muestra en la pantalla del ordenador en tiempo real. Poco a poco, ajuste el micrómetro el control de la etapa de traducción en la dirección del eje óptico para llevar la muestra en el punto focal del rayo láser.
10. Cuando la muestra está en el foco de fluoresceína, la emisión aparecerá como una línea clara en el CCD. Descargar la lectura de las intensidades de los píxeles del CCD a la computadora utilizando el programa informático de control de la cámara. Medir la intensidad de los píxeles en función de la posición en la matriz CCD mediante la apertura de la matriz de descarga de valores de intensidad en la imagen J y trazar una línea a través de la región fluorescentes. Utilice el comando J analizar el perfil de imagen → complot para crear un gráfico que ilustra el espectro de emisión de la muestra con fluoresceína.
11. Ajustar el parámetro incremental del espejo, que controla el movimiento del foco de láser en la dirección y, de manera que las posiciones y adyacentes en el resultado de la muestra en el movimiento de la punta de los espectros de fluorescencia por exactamente un píxel a lo largo de la dimensión espectral en el CCD matriz. Seguimiento de este mediante la descarga de los espectros de fluoresceína intensidad de la imagen un valor de dos posiciones diferentes y en la muestra, la apertura de las imágenes de intensidad con la J de la imagen, y la búsqueda de la posición de píxel máximo para cada uno de los espectros de fluorescencia utilizando el cursor J de la imagen.
12. Dejando el obturador abierto de la CCD, escanear el enfoque de láser a través de la muestra en la dirección x. La luz emitida por cada voxel a lo largo de la línea de la exploración debe caer incidente en el CCD.
13. Almacenar los datos de la matriz CCD obtenidos para este análisis de la línea y luego borrar los píxeles de la CCD.
14. Mover la posición del foco del láser en la dirección y por la cantidad determinada en el paso 11 de esta sección.
15. Escanear el rayo láser en la dirección x en la muestra, una vez más, dejando abierta la persiana de la ar CCDrayos y almacenar los datos.
16. Repita este procedimiento hasta que la línea de exploración un área física ~ 50% más grande que las dimensiones de una célula biológica única ha sido iluminada por la luz láser.
17. La relación entre el número de fila de una imagen de línea de lectura en particular y la longitud de onda debe ser utilizado para reconstruir las imágenes para obtener varios mapas de intensidad espacial xy fluorescente en longitudes de onda diferentes. Para obtener la imagen xy fluorescencia de emisión para una determinada longitud de onda (λ _j), encontrar el número de fila en la imagen obtenida de la exploración de primera línea que corresponde a esta longitud de onda. A continuación, la fila de al lado de la imagen de la línea posterior análisis corresponde a la siguiente fila de la imagen de emisión de fluorescencia de esa longitud de onda particular. Apilar todas las filas de la imagen que corresponde a esta longitud de onda para obtener los mapas xy fluorescentes intensidad espacial de la muestra a esa longitud de onda. Repita este procedimiento para todas las longitudes de onda puede obtener otros.
18. Para calcular la longitud de onda asociada a cada mapa de intensidad espacial xy fluorescentes, determinar la corrección de fondo a la intensidad de fluorescencia normalizada de cada imagen reconstruida como una función del índice de la imagen (j). La relación entre la posición de la cámara de píxeles en la dimensión espectral y la longitud de onda de los fotones emitidos es aproximadamente lineal, por lo tanto la relación entre las imágenes reconstruidas xy fluorescentes intensidad mapa espacial y longitud de onda correspondiente, también es lineal y se calcula de la siguiente manera:
    donde el valor de m está representado por:
    En el formalismo de arriba, el símbolo λ _j representa la longitud de onda de la imagen reconstruida j ^º. Los valores de λ _max y λ _½ se extraen de todo el espectro de emisión de la muestra con fluoresceína y corresponden a las longitudes de onda en la que la intensidad de la fluorescencia de la muestra fluorescencia es un máximo y la mitad del máximo, respectivamente. Los índices de la imagen j j _max y _media corresponden a las imágenes reconstruidas poseen la máxima intensidad de fluorescencia y la mitad del máximo, respectivamente.

4. Recopilación de datos sobre las muestras biológicas de interés

1. Para recoger datos sobre las muestras, en primer lugar eliminar de la incubadora de las placas con colonias de levaduras transformadas. Debe haber por lo menos tres tipos de células transformadas a todo lo ancho de media (FWHM):
   1. células que expresan las proteínas de interés marcados con ambos tipos de sondas fluorescentes
   2. células que expresan proteínas sólo etiquetados con las sondas fluorescentes de donantes, y
   3. células que expresan proteínas sólo etiquetados con las sondas fluorescentes aceptor.
2. Añadir 100 ml de KCl 100 mM a un tubo de microcentrífuga. Con una punta de micropipeta, raspar 3-5 colonias de levadura fuera de la placa de células que expresan proteínas etiquetadas con el donante y el receptor de sondas fluorescentes, y vacunar a los 100 mM KCl con estas células.
3. Retire 10 l de la suspensión celular y se dispensan en un portaobjetos de microscopio fresca, cubierta de la gota con un cubreobjetos, y coloque una gota de aceite en la superficie del cubreobjetos.
4. Cerrar manualmente el obturador en la trayectoria del haz de láser para bloquear la luz del láser de alcanzar el objetivo del microscopio.
5. Fije el portaobjetos del microscopio a la etapa de traducción xyz y traducir la diapositiva / etapa en la dirección del eje óptico hasta el objetivo del microscopio entra en contacto con la gota de aceite de inmersión.
6. La imagen de campo amplio de la muestra será muy borrosas debido a la presencia de la red de transmisión en el camino de las emisiones. Por lo tanto, colocar un filtro de banda con un FWHM pequeños en el camino óptico que precede a la red de transmisión. Encender la iluminación del campo de luz de ancho, y vaya al modo de vídeo de la cámara de recolección de datos. Poco a poco traducir la etapa de traducción en la dirección del eje óptico mientras ve la imagen de las células en la pantalla de la cámara hasta que las células se pusieron sobre la mesa
7. Traducir la etapa en la X o la dirección y con el fin de llevar una sola célula a la ubicación del foco del rayo láser.
8. Apague la fuente de iluminación de campo amplio. Quite el filtro de banda de la trayectoria de las emisiones.
9. Desbloquear el rayo láser durante un tiempo corto (<1 segundo), mientras ven la imagen de la señal recibida en el CCD. Si una señal fluorescente es detectada en el CCD durante el tiempo que el rayo láser incide sobre la celda, a continuación, realizar un análisis completo de fluorescencia de adquisición de datos de la celda. Es imprescindible la utilización de los mismos parámetros de exploración, en concreto el número de líneas y el incremento y, según lo determinado en el caprocedimiento de libración demostrado anteriormente.
10. Repita el proceso de ubicación de la celda y la fluorescencia de adquisición de datos para un gran número de células que expresan proteínas unido a las etiquetas de donantes y de las etiquetas aceptor.
11. Después de acumular imágenes de fluorescencia de células que expresan proteínas etiquetadas con ambos receptores, repetir todo el proceso tanto para las células que expresan proteínas sólo etiquetados con las sondas fluorescentes de los donantes y las células que expresan proteínas sólo etiquetados con las sondas fluorescentes aceptor.
12. Mediante el procedimiento descrito en la sección 3, reconstruir todos los análisis para obtener espectralmente resolver mapas xy fluorescentes espacial de la intensidad para cada conjunto de datos.

5. De análisis de imagen

Cada píxel de los mapas de intensidad de fluorescencia xy espacial, que resultan de una sola exploración de una célula biológica fluorescente, contiene el perfil completo del espectro del complejo molecular que residen en el voxel de excitación correspondiente a ese píxel en particular. Si las proteínas de interés que interactúan unos con otros, este perfil espectral contendrá una mezcla de las señales de ambos el donante y el receptor de sondas fluorescentes. Con el fin de determinar la naturaleza de las interacciones entre las proteínas de interés, los perfiles espectrales de un gran número de estos complejos de proteínas en una célula se deben tomar muestras y la aparente FRET eficiencia (E _app), definida como la proporción de los estados excitados de la sonda fluorescente que los donantes se transfiere a la sonda fluorescente aceptor a través de FRET, de cada píxel debe ser calculado.

1. Determinar el fondo con corrección de intensidad de fluorescencia para cada una de las imágenes reconstruidas se describe en la sección 4 de las células que expresan proteínas etiquetadas con sólo las sondas fluorescentes de los donantes y normalizar el valor máximo. Debido a que cada una de estas imágenes reconstruidas corresponde a una longitud de onda diferentes (λ _j) de esta colección de normalizaron los valores de intensidad de fluorescencia se corresponde con el espectro de emisión de las sondas de medida de los donantes, i ^D (λ _j).
2. Repita el paso 1 de las células que expresan proteínas etiquetadas con sólo las etiquetas fluorescentes aceptor para obtener el espectro de emisión de las sondas de medida aceptor, ^A i. (Λ _j) Puesto que la sonda aceptora se elige de manera que rara vez es directamente entusiasmados con la fuente de láser, la señal que emana de receptor de las muestras sólo se baja y, posiblemente, en el mismo orden de magnitud que las células autofluorescencia señal inherente. Por lo tanto, el espectro receptor de medida de fluorescencia calculado de esta manera puede ser necesario corregir para eliminar la contribución de la autofluorescencia antes de proceder.
3. Utilizando el espectro normalizado obtenido en el paso 1 y en el paso 2, se descomponen espectralmente cada pixel del espectro de emisión de fluorescencia de las células que expresan ambas proteínas marcadas con sondas fluorescentes de los donantes y las proteínas etiquetadas con aceptador de sondas fluorescentes con la relación I (λ _j) = k ^DA i ^D (λ _j) + k ^AD i ^A (λ _j), donde I (λ _j) representa cada uno de píxeles medida concreta espectro de fluorescencia. Los valores de k ^DA y ^AD k es proporcional a la emisión de fluorescencia de los donantes en la presencia de los aceptantes y de aceptores en la presencia de los donantes, respectivamente ^5.
4. Calcular la aparente FRET eficiencia que los mapas de la interacción de las proteínas de la célula en cada píxel con la fórmula, . Aquí, Q ^D y Q ^A es el rendimiento cuántico de la sonda fluorescente donante y receptor de la sonda fluorescente, respectivamente, y w w ^D y ^A son las integrales de los donantes normalizado y espectro de emisión aceptor, respectivamente, ^{19, 20.}
5. Por último, crear un histograma con los valores calculados de la _{aplicación de} E para cada píxel, donde se representa el número de veces que un valor E _{de la aplicación} específica que se produce en contra de determinado valor de E _aprox.

6. El análisis de histograma

Con el fin de extraer información cuantitativa de los histogramas E _{de la aplicación,} cada histograma es teóricamente encaja con una suma de funciones de Gauss, de acuerdo con la siguiente fórmula:
,
donde A _i es la amplitud, _i σ la desviación estándar, y _0i E la más probable FRET la eficiencia de la i ^ésima función de Gauss. Tamaño oligómero diferentess y las configuraciones de llevar a diferentes números (n) de E _0i y distintas correlaciones entre ellos ^{uno de 17.} Por ejemplo, para un tetrámero en forma de rombo, cinco picos se prevé, dadas por las expresiones que figuran en la Tabla 1.

Relación Tabla 1. Entre cada uno de los cinco valores de Gauss centro de pico y por parejas de la eficiencia de FRET previsto para un tetrámero con forma de rombo.

Eso significa que sólo un valor de E _0i necesita ser ajustado en el proceso de ajuste de datos - la que corresponde a un E _p -, mientras que los otros cuatro se calculan a partir del valor de E _p.

1. Asumir un modelo de oligómero e identificar el número de gaussianas para ser utilizado en la adaptación de la _aplicación e histogramas ^1. Ajustar el histograma mediante el ajuste de E _p, A _i, y σ _i. Tenga en cuenta que la disposición relativa de los histogramas es fijado por el modelo. Reducir al mínimo la chi cuadrado de la forma funcional o alguna otra bondad de ajuste.
2. Supongamos que otro modelo de oligómero probable y el número de repetir el paso 1.
3. Elija el modelo que mejor se ajuste a los datos sobre el número de parámetros utilizados. Que pueden requerir el uso de una prueba estadística (como la de chi cuadrado por el número de grados de libertad).

Resultados representante

Se ilustra en la Figura 1 son la resultante ^DA k, k ^AD y E, los mapas de _aplicación espacial calcula a partir de mediciones de espectro resueltos microscopia de dos fotones a cabo en una célula de levadura que expresan el estéril 2 α-factor (Ste2p) ^{21, 22.}

Figura 1. Célula de levadura que expresan el estéril de 2 α-receptor del factor. Mapas bidimensionales de los donantes (k ^DA) y las señales de aceptor (k ^AD) se obtuvieron a partir del procedimiento de deconvolución espectral aplicado a cada posición de píxel de las imágenes tomadas con el espectro resuelto de dos fotones microscopio de una célula de levadura que expresan el estéril de 2 α-receptor del factor (Ste2p). La intensidad de fluorescencia se asignan colores falsos de acuerdo a sus valores y la escala se muestra como un recuadro. Un mapa de dos dimensiones de la aparente traste eficiencia se calcularon utilizando ^la fiscalía y las imágenes k k ^AD.

Un histograma se preparó utilizando los valores extraídos del mapa _{de la aplicación} E de la celda se muestra en la Figura 1. Representado en la figura 2 es el histograma equipado correspondientes a los valores medidos _{de la aplicación} E (círculos) de la célula representada en la figura 1. La línea roja representa el mejor ajuste a los datos medidos con la suma de las funciones individuales de Gauss (verde líneas continuas).

Figura 2. Histograma de los valores _{de la aplicación} E de una célula de levadura que expresan el estéril 2 α-receptor del factor. El histograma que corresponde a los valores medidos (círculos) de la _aplicación E de la celda representada en la figura 1 se muestra. Las funciones individuales de Gauss (sólido líneas verdes) se suman para simular (línea roja continua) los valores medidos. Parámetros de Gauss función son: E ₀₁ = 16,7; A ₁ = 118,9; σ ₁ = 3,2; E ₀₂ = 25,1; A ₂ = 100,0; σ ₂ = 4,6; E ₀₃ = 32.6, A ₃ = ​​202,6; σ ₃ = 4,6; E ₀₄ = 40.1, A ₄ = 92.6, σ ₄ = 3,7; E ₀₅ = 50,1; A ₅ = 16,0; σ ₅ = 7.9.

Las relaciones entre Gauss medios necesarios para adaptarse a los datos presentados en el histograma de la Figura 2 se muestran en la Tabla 1. El número y la correlación entre las funciones de Gauss se corresponde con el número y las correlaciones entre los valores esperados E _{de la aplicación} de complejos en forma de rombo tetrámero oligómero. Por lo tanto, se desprende de la espectral resuelto de dos fotones medidas que el complejo Ste2p oligómero asume la forma de un tetrámero con forma de rombo en vivo ^19.

Discussion

En esta presentación, se muestra cómo determinar el tamaño y la información estructural de un complejo de proteínas oligómero in vivo. Aunque los datos presentados se obtuvieron de un receptor específico de membrana (es decir, Ste2p) expresado en células de levadura, el método es que todo lo abarca, ya que se puede aplicar a cualquier tipo de proteína expresada en cualquier tipo de célula, la única condición es que las proteínas están etiquetados con los marcadores fluorescentes adecuados. Futuras modificaciones a este protocolo requiere el refuerzo del instrumento para alcanzar altas velocidades de escaneo en un intento de controlar el tiempo depende del tamaño de oligómeros de proteínas y cambios en la estructura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope