Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

Summary

Empregando um espectralmente resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia, pixel-nível mapas de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eficiências são obtidas para células que expressam receptores de membrana para formar a hipótese de homo-oligoméricos complexos. Da FRET mapas eficiência, somos capazes de estimar informações sobre o complexo estequiométrico oligômero em estudo.

Abstract

O estudo de interações de proteínas em células vivas é uma importante área de pesquisa, pois as informações acumuladas tanto aplicações benefícios industriais, bem como aumenta o conhecimento fundamental biológico básico. Förster (fluorescência) Resonance Energy Transfer (FRET) entre uma molécula doadora em um estado eletronicamente animado e uma molécula de aceitador próxima tem sido freqüentemente utilizado para estudos de interações proteína-proteína em células vivas. As proteínas de interesse são marcados com dois tipos diferentes de sondas fluorescentes e expresso em células biológicas. As sondas fluorescentes são, então, animado, tipicamente utilizando a luz laser, e as propriedades espectrais da emissão de fluorescência que emana do sondas fluorescentes são recolhidas e analisadas. Informações sobre o grau de interações proteína é incorporada nos dados de emissão espectral. Tipicamente, a célula deve ser verificado um número de vezes para acumular informações suficientes espectral para quantificar com precisão a extensão das interações proteína para cada região de interesse dentro da célula. No entanto, a composição molecular dessas regiões pode mudar durante o curso do processo de aquisição, limitando a determinação espacial dos valores quantitativos da aparente FRET eficiências para uma média de células inteiras. Por meio de um microscópio resolvida espectralmente dois fótons, somos capazes de obter um conjunto completo de imagens espectralmente resolvido depois de apenas um scan de excitação completa da amostra de interesse. A partir destes dados pixel-nível espectral, um mapa da FRET eficiência em toda a célula é calculada. Através da aplicação de uma teoria simples de FRET em complexos oligoméricos à distribuição obtidos experimentalmente de FRET eficiência em toda a célula, uma única digitalização espectralmente resolvido revela informações estequiométrica e estrutural sobre o complexo de oligômero em estudo. Aqui nós descrevemos o processo de preparação de células biológicas (a levedura Saccharomyces cerevisiae) expressando receptores de membrana (estéril duas α-factor receptors) marcadas com dois tipos diferentes de sondas fluorescentes. Além disso, ilustrar os fatores críticos envolvidos na coleta de dados de fluorescência usando o espectro resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia. O uso deste protocolo pode ser prorrogado para estudar qualquer tipo de proteína que pode ser expresso em uma célula viva com um marcador fluorescente ligado a ele.

Protocol

1. Projeto plasmídeo

As proteínas de interesse são fundidos a uma de duas diferentes etiquetas fluorescentes, como descrito a seguir. As etiquetas fluorescentes não apenas fornecer informações sobre a localização das proteínas dentro da célula, mas também informação quantitativa sobre a homo-oligomerização da proteína ^1. A técnica de transferência de ressonância de fluorescência de Energia (FRET) ^2-4 é usado para acumular as informações sobre as interações proteína ^50-10. FRET utiliza o princípio de que uma transferência de energia pode ocorrer a partir de uma molécula opticamente animado (normalmente referido como o doador, D) de uma molécula não excitado (normalmente referido como aceitador, A) por meio de interações dipolo-dipolo ^11, se as duas moléculas vêm em grande proximidade um do outro. Ao projetar os plasmídeos que codificam as proteínas de fusão, duas características-chave deve ser tido em conta, como se segue.

1. Selecionar um par compatível de marcas fluorescentes é da maior importância na FRET estudos. Idealmente, a combinação tag fluorescentes devem atender a dois critérios: uma sobreposição apreciável em comprimentos de onda entre o espectro de emissão do doador e tag do espectro de excitação da tag aceptor, e uma separação grande entre o comprimento de onda centro do espectro pulso de laser eo espectro de excitação do receptor (ou seja, deslocamento Stokes grande). Duas variantes da proteína verde fluorescente ^{12, 13} são particularmente adequados para atender a esses critérios: o GFP ₂ como um doador de ¹⁴ e da proteína fluorescente amarela (YFP) ¹² ou uma variante dela chamada Venus ¹⁵ como o receptor. Cerulean ¹⁶ poderia também ser usado como um doador, embora com resultados um pouco mais modestos.
2. Em termos quantitativos FRET imagem é melhor se um único doador em um complexo molecular é animado ao mesmo tempo (em média), de modo que nenhuma competição ocorre entre os doadores para a transferência de energia para o receptor mesmo em complexos que contêm mais de um doador e um receptor . Isto leva a simplificações na teoria e ¹⁷ de dados processo de análise. Por causa disso, o nível do sinal é geralmente baixa. Para compensar isso, o nível de expressão das proteínas de interesse deve ser relativamente alta. Níveis de expressão de alta são alcançados usando uma cópia de alta plasmídeo para transportar o gene da proteína na célula.

2. Transformação de levedura

É vantajoso para maximizar a porcentagem da população de células expressando a proteína de interesse construções. Para este propósito, podemos transformar uma cepa auxotróficos de células de levedura (Saccharomyces cerevisiae), incapaz de produzir triptofano ou uracil, com dois plasmídeos diferentes, um contendo o triptofano marcador selecionável e uma do uracil marcador. Os plasmídeos também contêm os genes que carregam as instruções para a célula de expressar a proteína de interesse marcados com uma das duas sondas fluorescentes. As células transformadas são cultivadas em placas de meio sólido que também falta de triptofano e uracila. Pelo menos três tipos de células deve ser transformado: células que expressam as proteínas de interesse marcados com ambos os tipos de sondas fluorescentes, as células que expressam proteínas apenas marcados com as sondas fluorescentes doador e as células que expressam proteínas apenas marcados com as sondas aceptor fluorescente.

1. Prepare pratos meio sólido (1,7 g / L de levedura de nitrogênio base de w / o de aminoácidos, 1,6 g / L de levedura sintéticos abandono médio uracil w / o e triptofano, 2% [w / v] glicose, 2% [w / v] agar) para ser usado como meio de crescimento para as células transformadas pelo menos um dia antes da transformação celular. As placas de meio sólido pode ser usado por até dois meses após a preparação se ficará livre de qualquer contaminante.
2. Para cada par de plasmídeo para ser transformado, adicionar 10 mL de YPD (10 g / L extrato de levedura Bacto, 20 g / L Bacto peptonada, e 2% [w / v] glucose) para um erlenmeyer. Incoluate o YPD com uma colônia da cepa auxotróficos de células de levedura a ser transformado.
3. Coloque o erlenmeyer contendo a cultura de levedura em um agitador de laboratório, o que proporciona uma ação orbital rodando nas amostras, e incubar durante a 30 ° C. Na manhã seguinte, começar a monitorar o crescimento da cultura de células periodicamente a remoção de um pequeno volume de a cultura e teste de sua densidade óptica (DO). O crescimento da cultura de células deve ser em meados de logarítmica fase, ou seja, uma OD de 0,5-1,0, no momento da transformação.
4. Depósito 5 mL de ambos os tipos de plasmídeos em um tubo de microcentrífuga estéreis para cada par de plasmídeo para ser transformado.
5. Para cada par de plasmídeo para ser transformado, adicionar 5 mL de DNA de esperma de salmão (5 mg / ml) para um tubo de microcentrífuga vazio. Meia submergir o fundo do tubo de microcentrífuga contendo o DNA do esperma de salmão em água fervente por cinco minutos. Para evitar que a tampa do tubo de microcentrífuga de op poppingen, submerge apenas a metade inferior dos tubos de microcentrífuga na água. Depois de retirar da água a ferver, coloque o tubo de microcentrífuga contendo DNA de esperma de salmão no gelo por pelo menos dois minutos.
6. Adicionar 5 mL de DNA de esperma de salmão em cada tubo de microcentrífuga contendo plasmídeos.
7. Medir o OD da cultura de levedura crescendo para confirmar que chegou a meados de fase logarítmica (ou seja, leitura OD entre 0,5 e 1,0).
8. Centrifugar a suspensão de levedura na 1000xg por dois minutos.
9. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender o sedimento em levedura esterilizados água deionizada utilizando um misturador de vórtice.
10. Centrifugar a suspensão mais uma vez no 1000xg por dois minutos.
11. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em uma solução de 0,1 M LiOAc em TE (1,02 g LiAc, 10 mL de 1M Tris, pH 7,4 e 10 mL de EDTA 0,1 M pH 8,0). O volume de 0,1 M LiOAc em TE deve ser igual a 1 / ¹⁰⁰ do volume original levedura cultura em YPD.
12. Distribuir 100 mL de células para cada um dos tubos de microcentrífuga contendo os plasmídeos. Flick cada tubo delicadamente para misturar as células com os plasmídeos.
13. Adicionar 400 mL de 44% [w / v] polietileno glicol (PEG ₄₀₀₀₎ solução para cada um dos tubos de microcentrífuga.
14. Delicadamente misture o PEG ₄₀₀₀ com as células e plasmídeos. , A fim de evitar a quebra das células, não use um misturador vórtice neste momento. Suavemente para misturar, segurar a tampa microcentrífuga eo fundo do tubo de microcentrífuga entre o indicador eo polegar, lentamente inverter o tubo, e depois levar lentamente o tubo de volta para a posição vertical. Gire o tubo de 90 ° sobre seu eixo cilíndrico e lentamente inverter novamente. Repita esse processo várias vezes para que as células deslizar para baixo toda a superfície das paredes do tubo de microcentrífuga.
15. Coloque os tubos de microcentrífuga em uma incubadora a 30 ° por 45 minutos.
16. Após 45 de incubação minutos, retire as células da incubadora e repita o procedimento descrito suave mistura em 14.
17. Coloque os tubos de microcentrífuga em banho-maria 42 ° e incubar por 15 minutos. Mais uma vez, apenas mergulhe a metade inferior dos tubos de microcentrífuga na água.
18. Após a incubação ° 42, adicione 1 mL de água deionizada esterilizada aos tubos de microcentrífuga.
19. Centrifugue os tubos em uma microcentrífuga de mesa por 5 segundos. Retire o sobrenadante dos tubos utilizando uma micropipetter.
20. Adicionar 100 mL de água deionizada esterilizada a cada um dos tubos de microcentrífuga e misture a água deionizada esterilizada com as células usando o processo de inversão.
21. Adicionar o conteúdo de um tubo de microcentrífuga único para uma placa de meio de crescimento que seleciona para os plasmídeos acrescentado específico para que o tubo de microcentrífuga. Adicionar 4-6 gotas de vidro esterilizado (1 mm de diâmetro). Agite a placa contendo a gota de células de levedura transformadas e contas de vidro, a fim de que as células se espalham sobre a superfície do meio de cultivo ágar. Repita esse processo para cada conjunto de células transformadas.
22. Coloque as placas em um 30 ° incubadora de 3-5 dias. Depois de 3-5 dias, colônias de leveduras múltiplo de 1-3 mm de diâmetro será visível na superfície do meio de crescimento. Neste momento, as células estão prontos a ser trabalhada no espectralmente resolvido microscópio de dois fotões.

3. Calibrar o espectro resolvido microscópio de dois fótons

O espectralmente resolvido microscópio de dois fotões utilizados nestes estudos tem sido descrito em detalhe em outro lugar ^{18, 19.} Brevemente, uma alta potência de laser de estado sólido de onda contínua é usado para bombear um mode-locked Ti: laser Sapphire que gera pulsos de femtossegundos de comprimentos de onda variando de ~ 750-830 nm. O feixe de laser é focalizado por uma objectiva de alta microscópio NA a um ponto de difração limitada da amostra. Excitação só ocorre na região próxima focal do feixe devido à baixa probabilidade de dois fótons de excitação. Um par de ortogonais espelhos controlados por computador digitalização são usados ​​para traduzir o foco do feixe dentro do plano da amostra em duas direções diferentes (referido como direções x e y ao longo do protocolo). A emissão de fluorescência back-propagação de um voxel iluminada da amostra é disperso em componentes espectrais por uma grade de transmissão colocado no caminho da emissão antes da luz cai sobre o incidente de pixels de um array EM-CCD. Assim, o perfil completo espectral de qualquer molécula fluorescente / moléculas dentro da região focal do feixe é obtida ao longo de uma dimensão (direção y) do sensor CCD. Usando o movimento de um dos dois espelhos de digitalização, a localização do foco do laser podem ser digitalizados dentro da amostra ao longo de uma linha perpendicular à direção y. Ao manter o obturador da câmera CCD aberto durante essa varredura de linha única, os perfis espectrais da res moléculas fluorescentesiding ao longo de toda a linha da verificação são coletados em uma única varredura do feixe de laser através da amostra. Acumulando scans de várias linhas desta natureza em locais diferentes y dentro da célula dá os perfis espectrais de um grande número de complexos fluorescentes que residem dentro da amostra. As imagens obtidas a partir da linha de scans são reconstruídos para dar múltiplas xy mapas espaciais intensidade de fluorescência da amostra em comprimentos de onda diferentes ^{18, 19.} , A fim de reconstruir com precisão e calcular o comprimento de onda real correspondente aos mapas de intensidade xy fluorescentes espacial, o protocolo de verificação de linha deve ser calibrado utilizando uma amostra com um espectro de emissão de fluorescência bem caracterizados.

1. O espectralmente resolvido microscópio de dois fotões acumula informação espectral sobre os complexos oligômero na célula fotografada pela digitalização do foco do feixe de excitação através da amostra de interesse em um número de localizações.
2. Um par de espelhos ortogonais varredura é usado para traduzir o foco do feixe de laser através da amostra em duas direções diferentes. O movimento dos espelhos de varredura é controlado por computador e sincronizado com a extração de dados de intensidade de fluorescência da câmera CCD.
3. Scans da linha, mapas de intensidade fluorescente espacial correspondente a um determinado comprimento de onda da luz pode ser reconstruído. , A fim de reconstituir com precisão os mapas de intensidade xy fluorescentes espacial e calcular o comprimento de onda real correspondente a cada um desses mapas, o protocolo de verificação de linha deve ser calibrado usando uma solução de fluoresceína.
4. Para iniciar o procedimento de calibração, o centro do espectro de excitação no comprimento de onda de 800 nm, que é o comprimento de onda de excitação 2X máximo do tag doador, GFP _2. Ao centro do espectro de excitação, traduzir o prisma localizado dentro da cavidade laser para modificar a dispersão de velocidade de grupo. O prisma é montado sobre um computador controlado estágio motorizado linear.
5. Usando o programa de computador a câmara é ligada a, enviar um comando para o chip CCD para baixar a temperatura do chip CCD a sua temperatura mais baixa possível, a fim de reduzir o ruído escuro.
6. Pipeta mL de solução de fluoresceína 10 em uma lâmina de microscópio. Cobrir com uma lamela para que uma camada fina da amostra é uniformemente dispersa na região entre as lamelas e os lâmina de microscópio.
7. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão sobre a superfície da lamela
8. Agora aperte a lâmina de microscópio para a fase de tradução xyz e traduzir o slide / estágio na direção do eixo óptico ajustando manualmente o atuador linear que controla o movimento estágio na direção do eixo óptico. Traduzir o slide / estágio até a objetiva do microscópio entra em contato com a gota de óleo de imersão.
9. Usando o programa de computador que controla a câmera, mude para um modo de vídeo de aquisição de dados para que a luz emitida atingindo o sensor CCD é exibido na tela do computador em tempo real. Lentamente, ajustar o micrômetro controlar o estágio de tradução na direção do eixo óptico para levar a amostra para o ponto focal do feixe de laser.
10. Quando a amostra de fluoresceína está em foco, a emissão será exibido como uma linha nítida no sensor CCD. Baixar a leitura da intensidade dos pixels da matriz CCD para o computador usando o programa de computador que controla a câmera. Medir a intensidade de pixel como uma função da posição sobre a matriz CCD, abrindo a matriz baixado de valores de intensidade em J Imagem e desenhar uma linha através da região fluorescente. Use o comando J Analise de Imagem → Perfil Plot para criar uma trama que ilustram o espectro de emissão da amostra de fluoresceína.
11. Ajustar o parâmetro incremental do espelho que controla o movimento do foco do laser na direção y, tal que y posições adjacentes dentro do resultado da amostra no movimento do pico dos espectros de fluorescência por exatamente um pixel ao longo da dimensão espectral do CCD array. Monitorar isso baixando os espectros de fluoresceína imagem valor de intensidade para duas posições y diferentes na amostra, abrindo a intensidade com imagens Image J, e encontrar a posição de pixel de pico para cada um dos espectros de fluorescência usando o cursor J imagem.
12. Deixando o obturador aberto do CCD, digitalizar o foco do laser através da amostra na direção x. A luz emitida a partir de cada voxel ao longo da linha da verificação deve cair incidente sobre o sensor CCD.
13. Armazenar os dados do sensor CCD obtidos para este scan line e desmarque os pixels do sensor CCD.
14. Mover a posição do foco do laser na direção y pelo valor apurado no passo 11 desta seção.
15. Varredura do feixe de laser na direção x em toda a amostra, mais uma vez deixando em aberto o obturador do ar CCDray e armazenar os dados.
16. Repita este procedimento de linha de varredura até uma área física ~ 50% maior do que as dimensões de uma única célula biológica foi iluminado por uma luz laser.
17. A relação entre o número da linha de uma imagem em particular linha de varredura e comprimento de onda deve ser usada para reconstruir as imagens para obter múltiplos xy mapas espaciais intensidade de fluorescência em comprimentos de onda diferentes. Para obter a imagem xy emissão de fluorescência por um determinado comprimento de onda (λ _j), encontrar o número da linha na imagem obtida através do exame de primeira linha que corresponde a esse comprimento de onda. Em seguida, a linha adjacentes da imagem subseqüentes linha de varredura corresponde a linha próxima da imagem emissão de fluorescência para esse comprimento de onda particular. Pilha de todas as linhas de imagem que correspondem a esse comprimento de onda para obter os mapas de intensidade de fluorescência xy espacial da amostra no comprimento de onda. Repita esse procedimento para todos os outros comprimentos de onda obtidos.
18. Para calcular o comprimento de onda associada a cada mapa xy intensidade fluorescente espacial, determinar a intensidade de fluorescência de fundo corrigida normalizado de cada imagem reconstruída em função do índice de imagem (j). A relação entre a posição da câmera do pixel na dimensão espectral e comprimento de onda dos fótons emitidos é de aproximadamente linear, portanto a relação entre a intensidade fluorescente reconstruída xy imagens de mapa espacial e comprimento de onda correspondente também é linear e calculado da seguinte forma:
    onde o valor de m é representada por:
    No formalismo acima, o símbolo λ _j representa o comprimento de onda da imagem ^ª j reconstruído. Os valores de λ _max e _½ λ são extraídos do espectro de emissão da amostra de fluoresceína e correspondem aos comprimentos de onda na qual a intensidade de fluorescência da amostra fluorescentes é um máximo e meio no máximo, respectivamente. Os índices de imagem j _max e _½ j correspondem às imagens reconstruídas possuindo a intensidade máxima de fluorescência e metade do máximo, respectivamente.

4. Coleta de dados sobre amostras biológicas de interesse

1. Para coletar dados sobre suas amostras, primeiro remova da incubadora as placas com colônias de leveduras transformadas. Deve haver pelo menos três tipos de células transformadas de largura total metade do valor máximo (FWHM):
   1. células que expressam as proteínas de interesse marcados com ambos os tipos de sondas fluorescentes
   2. células que expressam proteínas apenas marcados com as sondas fluorescentes doador, e
   3. células que expressam proteínas apenas marcados com as sondas aceptor fluorescente.
2. Adicionar 100 mL de KCl 100 mM a um tubo de microcentrífuga. Usando uma ponta de micropipeta, raspar 3-5 colônias de leveduras fora do prato de células que expressam proteínas marcadas com dador e do receptor de sondas fluorescentes, e inocular a 100 mM KCl com essas células.
3. Remover 10 L da suspensão de células e dispensá-la numa lâmina de microscópio fresco, cobrir a gota com uma lamínula e coloque uma gota de óleo na superfície da lamela.
4. Manualmente fechar o obturador no caminho do feixe de laser para bloquear a luz do laser de chegar à objetiva do microscópio.
5. Fixe a lâmina de microscópio para a fase de tradução xyz e traduzir o slide / estágio na direção do eixo ótico até que a objetiva do microscópio entra em contato com a gota de óleo de imersão.
6. A imagem amplo campo da amostra será severamente turva por causa da presença da grade de transmissão no caminho de emissões. Portanto, colocar um filtro passa-banda com uma FWHM pequenos no caminho óptico anterior à grade de transmissão. Ligue a iluminação ampla campo de luz, e ir para o modo de vídeo da câmera de coleta de dados. Lentamente traduzir o estágio de tradução na direção do eixo óptico durante a visualização da imagem das células na tela da câmera até que as células são levados em foco
7. Traduzir o estágio em ambos os x ou y a direção, a fim de trazer uma única célula para a localização do foco do feixe laser.
8. Desligue a fonte de iluminação ampla de campo. Retire o filtro passa-banda a partir do caminho de emissões.
9. Desbloquear o feixe de laser para um curto período de tempo (<1 segundo) e, simultaneamente, visualizar o sinal recebido no sensor CCD. Se um sinal fluorescente é detectado no sensor CCD durante o tempo que o feixe de laser incide sobre a célula, em seguida, executar uma varredura completa aquisição de fluorescência de dados deste celular. É vital para utilizar os mesmos parâmetros de digitalização, especificamente o número de linhas e incremento y, conforme determinado na caprocedimento libration demonstrado anteriormente.
10. Repita a localização celular e processo de aquisição de fluorescência de dados para um grande número de células que expressam proteínas associadas às tags dador e do receptor de etiquetas.
11. Depois de acumular imagens de fluorescência de células que expressam proteínas marcadas com ambos os receptores, repita todo o processo para ambas as células que expressam proteínas apenas marcados com as sondas fluorescentes doador e as células que expressam proteínas apenas marcados com as sondas aceptor fluorescente.
12. Utilizando o procedimento descrito na seção 3, reconstruir todas as digitalizações para obter espectralmente resolvido xy mapas intensidade fluorescente espacial para cada conjunto de dados.

5. Análise de imagem

Cada pixel dos mapas de intensidade xy fluorescentes espaciais, que resultam de uma simples pesquisa de uma célula biológica fluorescentes, contém o perfil completo espectral do complexo molecular que residem na excitação voxel correspondente a esse pixel particular. Se as proteínas de interesse estão interagindo uns com os outros, este perfil espectral irá conter uma mistura de sinais de doador e receptor de sondas fluorescentes. A fim de determinar a natureza das interações entre as proteínas de interesse, os perfis espectrais de um grande número destes complexos de proteínas em uma célula devem ser colhidas amostras eo aparente FRET eficiência (E _app), definida como a proporção dos estados animado da sonda fluorescente que se tornam doadores transferido para a sonda fluorescente aceitador via FRET, de cada pixel devem ser calculados.

1. Determinar a luminosidade corrigida intensidade de fluorescência para cada uma das imagens reconstruídas descrito na seção 4 para células que expressam proteínas marcadas com apenas as sondas fluorescentes doador e normalizar o valor máximo. Porque cada uma dessas imagens reconstruídas corresponde a um comprimento de onda separados (λ _j) este conjunto de valores normalizados intensidade de fluorescência corresponde ao espectro de emissão medidos das sondas de doadores, i ^D (λ _j).
2. Repita o passo 1 para as células que expressam proteínas marcadas com apenas as tags aceptor fluorescente para obter o espectro de emissão medidos das sondas aceitador, i ^A. (Λ _j) Uma vez que a sonda aceitador é escolhido de forma que raramente é animado diretamente usando a fonte de laser, o sinal proveniente de aceitador apenas amostras será baixo e, possivelmente, na mesma ordem de grandeza que as células de sinal inerente autofluorescência. Portanto, o espectro de fluorescência medidos aceitador calculado desta forma poderá ter de ser corrigidos para remover a contribuição da autofluorescência antes de prosseguir.
3. Utilizando o espectro normalizado obtida na etapa 1 e no passo 2, espectralmente decompor cada pixel do espectro de emissão de fluorescência de células que expressam ambas as proteínas marcadas com sondas fluorescentes dos doadores e as proteínas marcadas com aceitador sondas fluorescentes usando a relação I (λ _j) = k ^DA i ^D (λ _j) + k ^AD i ^A (λ _j), onde I (λ _j) representa cada pixels medidos em particular o espectro de fluorescência. Os valores de k ^DA e ^AD k são proporcionais à emissão de fluorescência de doadores, na presença de receptores e de receptores, na presença de doadores, respectivamente ^5.
4. Calcular a eficiência FRET aparente que mapeia a interação de proteínas na célula em cada pixel usando a fórmula, . Aqui, Q e Q ^{A D} são os rendimentos quânticos de sonda fluorescente doador e receptor de sonda fluorescente, respectivamente, e w ^D e ^A w são as integrais do doador normalizado e espectro de emissão aceitador, respectivamente ^{19, 20.}
5. Finalmente, criar um histograma usando os valores calculados de _app E para cada pixel, onde o número de vezes que um valor específico _app E ocorre é plotado contra o valor particular de E _app.

6. Análise de histograma

A fim de extrair informação quantitativa a partir do _aplicativo E histogramas, cada histograma é teoricamente se encaixam com uma soma de funções gaussianas, de acordo com a seguinte fórmula:
,
onde A _i é a amplitude, _i σ o desvio padrão, e _0i E o mais provável FRET eficiência da função gaussiana i ^om. Tamanho oligômero diferentess e configurações levar a números diferentes (n) de _0i E e diversas correlações entre eles ^{um de 17.} Por exemplo, para um tetrâmero em forma de losango, cinco picos são previstos, dada pelas expressões listadas na Tabela 1.

Tabela 1. Relação entre cada um dos cinco valores Gaussian centro de pico e os pares FRET eficiência previsto para um tetrâmero losango em forma.

Isso significa que apenas um valor de E _0i precisa ser ajustado no processo de montagem de dados - o correspondente a E _p - enquanto os outros quatro são computados a partir do valor de E _p.

1. Assumir um modelo de oligômero e identificar o número de gaussianas para ser usado na montagem do E _app histogramas ^1. Fit o histograma, ajustando E _p, A _{i, i} e σ. Note-se que a disposição relativa dos histogramas é fixado pelo modelo. Minimizar o qui-quadrado do ajuste ou algum outro goodness-of-fit funcional.
2. Assumir outro modelo oligômero provável e repita o passo número 1.
3. Escolha o modelo que melhor se ajustam os dados para o número de parâmetros utilizados. Que podem exigir o uso de um teste estatístico (como o qui-quadrado, por número de graus de liberdade).

Resultados representante

Ilustrada na Figura 1 são a resultante k ^DA, k ^AD, e mapas E _app espacial calculado a partir espectralmente resolvido medições de dois fótons de microscopia realizada em uma célula de levedura expressando a 2 Estéril α-fator (Ste2p) ^{21, 22.}

Figura 1. Célula de levedura expressando o estéril 2 receptor α-fator. Bidimensional mapas do doador (k ^DA) e (k ^AD) aceitador sinais foram obtidos a partir do procedimento de deconvolução espectral aplicada a cada localização de pixel de imagens tiradas com espectralmente resolvido de dois fótons microscópio de uma célula de levedura expressando o estéril 2 receptor α-fator (Ste2p). Intensidades de fluorescência são atribuídas cores falsas de acordo com seus valores ea escala é mostrada como uma inserção. Um mapa bidimensional da aparente fret eficiências foram calculadas utilizando a ^DA e imagens k k ^AD.

Um histograma foi preparado com os valores extraídos do mapa _app E da célula mostrado na Figura 1. Retratado na Figura 2 é o histograma equipado correspondentes aos valores medidos E _app (círculos) da célula na Figura 1. A linha vermelha sólida representa o melhor ajuste aos dados medidos utilizando a soma das funções individuais Gaussian (verde linhas sólidas).

Figura 2. Histograma de valores _app E para uma célula de levedura expressando o estéril 2 receptor α-fator. O histograma que corresponde aos valores medidos (círculos) de _app E para a célula na Figura 1 é mostrada. Funções individuais Gaussian (sólido linhas verdes) são somados para simular (linha vermelha sólida) os valores medidos. Parâmetros da função gaussiana são: E ₀₁ = 16,7; A ₁ = 118,9; σ ₁ = 3,2; E ₀₂ = 25,1; A ₂ = 100,0; σ ₂ = 4,6; E ₀₃ = 32,6; A ₃ = ​​202,6; σ ₃ = 4,6; E ₀₄ = 40,1; A ₄ = 92,6; σ ₄ = 3,7; E ₀₅ = 50,1; A ₅ = 16,0; σ ₅ = 7,9.

As relações entre Gaussian meios necessários para ajustar os dados apresentados no histograma da Figura 2 são apresentados na Tabela 1. O número e correlação entre as funções gaussianas corresponde ao número e correlações entre os valores esperados E _app para rhombus complexos oligômero forma tetrâmero. Portanto, é evidente a partir do espectro resolvido dois fótons medidas que o complexo Ste2p oligômero assume a forma de um tetrâmero losango forma in vivo ^19.

Discussion

Nesta apresentação, que ilustrou como para determinar o tamanho e as informações estruturais sobre um complexo de oligômero proteína in vivo. Embora os dados apresentados foram obtidos a partir de um receptor de membrana específica (ie Ste2p), expresso em células de levedura, o método é abrangente na medida em que pode ser aplicado a qualquer tipo de proteína expressa em qualquer tipo de célula, a única condição é que as proteínas são marcadas com os marcadores adequados fluorescentes. Modificações futuras a este protocolo passa por um reforço do instrumento para alcançar altas velocidades de varredura em uma tentativa de monitorar o tempo-dependente tamanho oligômero proteína e mudanças na estrutura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope