Summary
Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.
Abstract
Canlı hücreler protein etkileşimleri çalışma, bilgi hem faydaları yanı sıra endüstriyel uygulamalar temel temel biyolojik bilgi artar birikmiş çünkü önemli bir araştırma alanıdır. Elektronik heyecanlı bir devlet bir bağış molekülü ve yakındaki bir alıcısı molekül arasında Förster (Floresan) Rezonans Enerji Transferi (FRET) canlı hücreler protein-protein etkileşimleri çalışmaları için sık sık kullanılmıştır. Ilgi proteinler, floresan probları iki farklı tipleri ile etiketlenen ve biyolojik hücreleri ifade edilir. Sonra floresan probları genellikle lazer ışığı kullanarak, heyecanlı, ve floresan probları yayılan floresan emisyon spektral özellikleri toplanmakta ve analiz edilmektedir. Protein etkileşimleri derecesi ile ilgili bilgiler, spektral emisyon verileri yerleştirilmiştir. Tipik olarak, hücre, hücre içindeki ilgi her bölge için protein etkileşimleri ölçüde doğru ölçmek için yeterli spektral bilgi biriktirmek için birkaç kez tarandıktan olmalıdır. Ancak, bu bölgelerde moleküler bileşimi tüm hücreleri üzerinde bir ortalama belirgin FRET verimlilikleri nicel değerler mekansal belirlenmesi sınırlayarak, satın alma sürecinin seyri sırasında değişebilir. Işıksal çözülmesi iki foton mikroskop sayesinde biz faiz örnek sadece bir uyarma tarama sonra Işıksal çözüme tam bir set görüntüleri elde edebiliyoruz. Bu piksel düzeyinde spektral veri, bir harita FRET hücre boyunca verimliliği hesaplanır. Deneysel olarak elde edilen dağıtım oligomerik komplekslerinde FRET basit bir teori uygulayarak hücre boyunca verimliliği FRET, tek bir Işıksal çözülmesi tarama çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik ve yapısal bilgiler ortaya koymaktadır. Burada floresan probları iki farklı tipleri ile etiketlenen membran reseptörleri (steril 2 α-faktörü reseptörleri) ifade biyolojik hücreleri (maya Saccharomyces cerevisiae) hazırlama prosedürü açıklar. Ayrıca, spektral çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak floresans veri toplama dahil kritik faktörler göstermektedir. Bu protokolün, bir floresan işaretleyici ile ona bağlı yaşayan bir hücre olarak ifade edilebilir protein her türlü çalışma uzatılabilir.
Protocol
1. Plazmid tasarım
Ilgi proteinler sonraki açıklandığı gibi, iki farklı floresan etiket birine kaynaşmıştır. Floresan etiketleri sadece protein 1 homo-oligomerization ilgili proteinlerin hücre içinde yer değil, aynı zamanda niceliksel bilgiler hakkında bilgi sağlamaz. Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) 2-4 tekniği 5-10 protein etkileşimleri hakkında bilgi biriktirmek için kullanılır. FRET bir enerji transferi, heyecansız bir molekülü dipol-dipol etkileşimleri 11 üzerinden (genellikle alıcısı, A olarak anılacaktır), optik heyecanlı bir molekülün (genellikle donör, D olarak anılacaktır) oluşabilir prensibi kullanır, eğer iki molekül birbirlerine yakın geliyor. Füzyon proteinleri kodlayan plazmid tasarımı, iki önemli özelliği akılda olmalıdır, aşağıdaki gibidir.
- Uyumlu bir çift floresan etiketleri seçilmesi, çalışmalar FRET büyük önem taşımaktadır. Donör etiketi emisyon spektrumu ve ikaz alıcısı etiketi spektrum ve lazer darbe yelpazenin merkezinde dalga boyu ve ikaz spektrumu arasında büyük bir ayrılık arasındaki dalga boylarında da kayda değer bir örtüşme: İdeal olarak, floresan etiketi kombinasyonu iki kriterleri karşılaması gerekir akseptör (yani, büyük Stokes kayması). Bir donör 14 ve sarı floresan protein (YFP) 12 ya da alıcısı olarak Venüs-15 adı verilen bir varyantı olarak GFP 2: İki değişik yeşil floresan protein 12, 13, özellikle de bu kriterleri karşılamak için uygundur. Cerulean 16, biraz daha mütevazı sonuçlar de olsa bir bağış olarak da kullanılabilir olabilir.
- Kantitatif görüntüleme FRET bir moleküler kompleks sadece bir donör bağışçılar arasında, birden fazla verici ve bir alıcısı içeren kompleksleri aynı alıcı için enerji transferi için herhangi bir rekabet oluşur, böylece bir defada (ortalama) heyecan ise en iyi . Bu teori ve veri analiz süreci 17 sadeleştirmeler açar. Bu yüzden, sinyal seviyesi genellikle düşüktür. Bunu dengelemek için faiz proteinlerin ekspresyon seviyesi nispeten yüksek olmalıdır. Yüksek ekspresyon düzeyleri hücre içine protein geni taşıyan plazmid yüksek bir kopyasını kullanarak elde edilir.
2. Maya dönüşüm
Bu, faiz protein yapıları ifade hücre popülasyonunun oranını en üst düzeye çıkarmak için avantajlıdır. Bu amaçla, iki farklı plazmid, seçilebilir marker triptofan içeren bir ve bir marker urasil, triptofan veya urasil üretemez maya hücreleri (Saccharomyces cerevisiae) auxotrophic gerilme dönüşümü. Plazmid de, iki floresan probları ile etiketlenen ilgi protein ifade etmek için hücre için talimatları taşıyan genler içerir. Dönüştürülmüş hücreleri, triptofan ve urasil eksikliği katı orta plakalar üzerinde yetiştirilmektedir. En az üç çeşit hücre dönüştürülmesi gerektiğini ilgi proteinler ifade hücrelerin iki tip floresan probları, sadece, alıcı floresan problar ile etiketlenen tek proteinleri ifade donör floresan problar ve hücreler ile etiketlenen proteinler ifade hücreleri ile etiketlenen.
- Katı orta tabak hazırlayın (maya azot baz w / o amino asitler, 1.6 g / L maya sentetik ayrılma orta w / o urasil ve triptofan,% 2 w / v] glikoz,% 2 [w / v] 1.7 g / L hücre dönüşümü en az bir gün önce dönüştürülmüş hücreleri için büyüme ortamı olarak kullanılmak üzere agar). Herhangi bir kirleticinin serbest kalması durumunda katı besiyeri plakaları hazırlandıktan sonra iki ay kadar kullanılmış olabilir.
- Her plazmid çifti dönüştürülmüş olması için, bir erlen YPD (10 g / L Bacto Maya Özü, 20 g / L Bacto Peptonlu ve% 2 [w / v] glukoz) 10 ml ekleyin. Maya hücreleri auxotrophic gerginlik dönüştürülecek bir koloni YPD Incoluate.
- Numuneler üzerinde bir yörünge dönen eylem sağlayan bir laboratuvar Shaker, maya kültürü içeren erlen yerleştirin ve 30 gece boyunca inkübe ° C. Ertesi sabah, periyodik olarak küçük bir hacim kaldırarak hücre kültürü büyümenin izlenmesi kültür ve optik yoğunluk (OD) test. Dönüşüm zamanda hücre kültürü büyüme, 0.5-1.0 bir OD, yani, orta-logaritmik faz olmalıdır.
- Her plazmid çifti için, steril bir mikrosantrifüj tüpe plazmidler her iki tip Depozito 5 mcL dönüştürülebilir.
- Her plazmid çifti dönüştürülmüş olması için, boş bir mikrosantrifüj boru somon Sperm DNA (5 mg / ml) 5 mcL ekleyin. Batmak beş dakika kaynar suda somon sperm DNA içeren mikrosantrifüj tüp alt yarısı. Haşhaş op mikrosantrifüj tüp kap önlemek içintr, sadece batığın su mikrosantrifüj tüplerin alt yarısında. Kaynar su çıkardıktan sonra, en az iki dakika boyunca buz somon sperm DNA içeren mikrosantrifüj tüp yerleştirin.
- Plazmid içeren her mikrosantrifüj tüp somon sperm DNA 5 mcL ekleyin.
- Orta-logaritmik faz (0.5 ve 1.0 arasında yani OD okuma) ulaştığını teyit etmek için büyüyen maya kültürü OD ölçün.
- Iki dakika 1000xg maya süspansiyon santrifüjleyin.
- Süpernatantı dökün ve bir vorteks karıştırıcı kullanılarak steril deiyonize su maya pelet tekrar süspansiyon.
- 1000xg az iki dakika boyunca tekrar süspansiyon santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve TE 0.1M LiOAc bir çözüm pelet (1.02 g LiAc 1M Tris, pH 7.4 'de 10 ml ve 10 ml 0,1 M EDTA pH 8,0) tekrar süspansiyon haline getirin. TE 0.1M LiOAc hacmi YPD özgün maya kültürü hacminin 1 / 100 inci eşit olmalıdır.
- Plazmid içeren mikrosantrifüj tüplerin her hücre 100 mcL dağıtın. Plazmid hücrelerin karışımı için yavaşça her tüp Flick.
- [W / v] polietilen glikol (PEG 4000) çözümü mikrosantrifüj tüplerin her biri için% 44 400 mcL ekleyin.
- Hücreleri ve plazmid ile PEG 4000 hafifçe karıştırın. Hücrelerin kırılma önlemek için, bu noktada bir vorteks mikser kullanmayın. Hafifçe karıştırın, mikrosantrifüj kap ve işaret parmağı ve başparmak arasında mikrosantrifüj tüp altında tutun, yavaşça tüp ters ve sonra yavaş yavaş geri tüp dik pozisyonda getirmek. Silindirik eksen etrafında tüp 90 ° çevirin ve yavaş yavaş tekrar ters. Bu süreç, hücrelerin mikrosantrifüj tüp duvarlarının tüm yüzey alanını aşağı kaydırın, böylece bir kaç kez tekrarlayın.
- 45 dakika boyunca 30 ° inkübatör mikrosantrifüj tüplerini yerleştirin.
- 45 dakika inkübasyondan sonra, inkübatör hücreleri kaldırmak ve 14 olarak açıklanan nazik karıştırma işlemi tekrarlayın.
- 42 ° su banyosu mikrosantrifüj tüplerini yerleştirin ve 15 dakika inkübe edin. Bir kez daha, sadece batığın su mikrosantrifüj tüplerin alt yarısında.
- 42 ° inkübasyondan sonra, mikrosantrifüj tüpler için 1 ml steril deiyonize su ekleyin.
- 5 saniye boyunca bir masaüstü mikrofuge'ye tüpler santrifüjleyin. Micropipetter kullanarak tüpleri süpernatantı.
- Mikrosantrifüj tüplerin her birine 100 mcL steril deiyonize su ekleyin ve inversiyon işlemi kullanarak hücreleri ile steril deiyonize su karışımı.
- Bu mikrosantrifüj tüpüne eklenen özellikle plazmid için seçtiği bir büyüme levha, tek bir mikrosantrifüj tüp içeriği ekleyin. 4-6 steril cam boncuk (1 mm çapında) ekleyin. Damlacık agar besi yüzey hücreleri yayılmış olduğu için dönüşüm maya hücreleri ve cam boncuklar içeren plaka çalkalayınız. Dönüştürülmüş hücrelerinin her set için bu işlemi tekrarlayın.
- 3 - 5 gün 30 ° inkübatör tabak koyun. 3-5 gün sonra, 1-3 mm çapında birden fazla maya kolonileri büyüme orta yüzeyinde görünür olacaktır. Şu anda, hücrelerin Işıksal çözülmesi iki foton mikroskop imaged olmaya hazırız.
3. Işıksal çözülmesi iki foton mikroskop kalibre etme
Bu çalışmalarda kullanılan iki foton mikroskop Işıksal çözülmesi 19, başka bir yerde 18 detaylı olarak tarif edilmiştir. ~ 750 - 830 nm arasında değişen dalga boylarında femtosecond bakliyat üreten Sapphire lazer: Kısaca, yüksek güçte bir solid-state sürekli dalga lazer modu-kilitlendi Ti pompalamak için kullanılır. Lazer ışını, örnek bir kırınım sınırlı bir noktaya yüksek NA mikroskop objektif odaklanmıştır. Tahrik olma sadece iki foton uyarma düşük olasılık nedeniyle ışın yakın odak bölgede oluşur. Bir çift dik bilgisayar kontrollü tarama aynalar, iki farklı yönlere (protokol boyunca, x ve y yönlerinde olarak anılacaktır) örnek uçağın içinde demetinin odağı çevirmek için kullanılır. Örnek bir ışıklı voksel arka yayılan floresans emisyon emisyon yolunda ışık, bir EM-CCD dizinin piksel üzerine olay düşmeden önce yerleştirilen bir iletim ızgara spektral bileşenleri içine dağılır. Böylece, ışın odak bölge içinde herhangi bir floresan molekül / moleküller tam spektral profil CCD dizinin tek bir boyut (y yönünde) boyunca elde edilir. Iki tarama ayna hareketi kullanarak, lazer odak konumunu y yönünde dik bir çizgi boyunca örnek içinde taranabilir. Bu tek satır tarama, floresan moleküller res spektral profilleri sırasında deklanşöre CCD kamera açık tutaraktüm tarama hattı boyunca tek bir örnek üzerinden lazer ışını süpürme iding toplanır. , Hücre içinde farklı y yerlerde bu nitelikteki birden çok satırı tarar Biriken numune içinde ikamet eden, çok sayıda floresan kompleksleri spektral profilleri verir. Çizgi taramalar elde edilen görüntüler, birden fazla xy floresan farklı dalga boylarında 18, 19 örnek uzamsal haritalar vermek için yeniden . Doğru yeniden ve xy floresan yoğunluğu uzamsal haritalar karşılık gelen gerçek dalga boyunu hesaplamak için, çizgi tarama protokolü iyi karakterize floresans emisyon spektrumuna sahip bir örneklem kullanılarak kalibre edilmelidir.
- Işıksal çözülmesi iki foton mikroskop yerlerde çok sayıda örnek ilgi karşısında uyarma demetinin odağı tarama görüntülü hücre oligomer kompleksleri hakkında spektral bilgi birikir.
- Dik tarama ayna bir çift, iki farklı yönlere örnek üzerinden lazer ışınının odak çevirmek için kullanılır. Tarama aynalar hareket bilgisayar kontrollü ve CCD kamera floresan veri çıkarma ile senkronize.
- Satırını tarar, ışığın belli bir dalga boyuna karşılık gelen floresan yoğunluğu uzamsal haritalar elde edilebilir. Doğru xy floresan yoğunluğu uzamsal haritalar yeniden ve bu haritalar her birine karşılık gelen gerçek dalga boyunu hesaplamak için, çizgi tarama protokol floresein çözüm kullanılarak kalibre edilmelidir.
- Kalibrasyon prosedürünün başlaması için, merkez 2X donör etiketi maksimum dalgaboyu, GFP 2 800 nm dalga boyu, uyarma spektrum. Uyarım spektrumu merkezi için, grup hızı dispersiyon değiştirmek için lazer boşluğu içinde bulunan prizma çevirmek. Prizma lineer motorlu aşaması kontrollü bir bilgisayar üzerinde monte edilir.
- Bilgisayar programı kullanarak kamera CCD çipi karanlık gürültüsünü azaltmak için, en düşük ulaşılabilir sıcaklık CCD çipi sıcaklığı düşürmek için bir komut göndermek için arabirim.
- Pipet 10 mcL bir mikroskop lamı üzerine floresein çözüm. Örnek ince bir tabaka lamel ve mikroskop lamı arasındaki bölgede eşit dağılır, böylece bir lamel ile kaplayın.
- Lamel yüzeyinde küçük bir damla immersiyon yağı koyun
- Şimdi xyz çeviri aşamasına mikroskop lamı tutturmak ve optik ekseni yönünde sahne hareketi kontrol lineer aktüatör elle ayarlayarak optik ekseni yönünde slayt / sahne çevirmek. Mikroskop objektif damla immersiyon yağı ile temas kadar slayt / sahne Çevir.
- Yayılan ışık CCD dizisi çarpıcı gerçek zamanlı olarak bilgisayar ekranında görüntülenir, böylece veri toplama bir video moduna geçiş, kamera kontrol eden bir bilgisayar programı kullanarak. Yavaşça, örnek lazer ışınının odak nokta haline getirmek için optik ekseni yönünde çeviri aşamasında kontrol mikrometre ayarlayın.
- Floresein örnek odaklanma olduğunda, emisyon CCD dizi keskin bir çizgi olarak görünecektir. Piksel CCD dizi kamera kontrol eden bir bilgisayar programı kullanarak bilgisayara şiddetleri okuma indirin. Görüntü J yoğunluğu değerleri indirilen matris açılması ve floresan bölge boyunca bir çizgi çizerek CCD dizi pozisyonunun bir fonksiyonu olarak piksel yoğunluğunu ölçün. Resim J komutu → Arsa bilgileri analiz floresein örnek emisyon spektrumu gösteren bir komplo oluşturmak için kullanın.
- Y yönünde lazer odak hareketini kontrol, numune sonuç tam bir piksel CCD spektral boyut boyunca floresans spektrumları tepe hareket içinde, bitişik y konumları ayna artımlı parametre ayarlayın. dizi. Bu örnek iki farklı y pozisyonlar için floresein spektrumları yoğunluk değeri görüntüsü indirirken, Görüntü J yoğunluğu görüntüler açılış ve floresans spektrumları Resim J imleci kullanarak her biri için pik piksel pozisyonu bulma izleyin .
- CCD açık enstantane bırakmak, x yönünde örnek üzerinden lazer odak tarayın. Tarama hattı boyunca her voksel yayılan ışık CCD dizi üzerine olay düşmelidir.
- CCD diziden bu satırı tarama için elde edilen verileri depolamak ve piksel CCD dizi temizlemek.
- Bu bölümde 11 adım belirlenen miktarda lazer odak konumunu y yönünde hareket ettirin.
- Bir kez daha CCD ar obtüratör açık bırakarak, örneklem genelinde x yönünde lazer ışını taramaray ve veri depolamak.
- Fiziksel bir alana kadar bu hat tarama prosedürü tekrarlayın tek bir biyolojik hücre boyutlarına göre% 50 daha büyük lazer ışığı ile aydınlatılmış oldu.
- Satır sayısı belirli bir line-scan görüntüsü ve dalga boyu arasındaki ilişki, farklı dalga boylarında birden fazla xy floresan yoğunluğu uzamsal haritalar elde etmek için görüntüleri yeniden kullanılmalıdır . Belli bir dalga boyu (λ j) xy floresans emisyon görüntü elde etmek için, bu dalga boyuna karşılık gelen ilk satırı tarama elde edilen görüntünün satır sayısını bulmak. Sonra sonraki line-scan görüntüsü bitişik satır, o belirli bir dalga boyu için floresans emisyon görüntüsünün sonraki satıra karşılık gelir. Bu dalga boyu, o dalga boyunda örnek xy floresan yoğunluğu uzamsal haritalar elde karşılık tüm görüntü satır üst üste koyun . Elde edilebilecek tüm diğer dalga boyları için bu yordamı yineleyin.
- Her xy floresan yoğunluğu mekansal harita ile ilişkili dalga boyunu hesaplamak için, arka plan düzeltilmiş resim indeks (j) bir fonksiyonu olarak yeniden inşa edilen her görüntünün normalize floresan yoğunluğu belirler. Kamera piksel spektral boyutta konumu ve fotonların dalga boyu arasındaki ilişki yaklaşık lineer, bu nedenle yeniden inşa xy floresan yoğunluğu mekansal harita görüntüleri ve buna karşılık gelen dalga boyu arasındaki ilişki de lineer ve aşağıdaki gibi hesaplanır:
m değeri ile temsil edilmektedir: 
Yukarıdaki biçimcilik, sembol λ j j. yeniden inşa görüntü dalga boyunu temsil eder. Λ max ve λ değerleri ½ floresein örnek emisyon spektrumu çıkarılır ve sırasıyla floresanlama numunenin floresans yoğunluğu maksimum, maksimum ve yarım hangi dalga boylarında karşılık gelir. Görüntü endeksleri ½ j max ve j sırasıyla maksimum floresans yoğunluğu ve maksimum bir buçuk sahip yeniden inşa görüntülere karşılık gelir.
m değeri ile temsil edilmektedir: 
4. Ilgi biyolojik örnekler üzerinde Veri Toplama
- Numuneler üzerinde veri toplamak için, ilk dönüştürülmüş maya kolonileri ile inkübatör plakaları kaldırmak. En az üç çeşit olmalıdır dönüştürülmüş hücreleri yarı-maksimum tam genişlik (FWHM):
- ilgi proteinlerin ifade hücreleri iki türlü floresan probları ile etiketlenen
- , donör floresan problar ile etiketlenen tek proteinleri ifade hücreleri ve
- sadece alıcı floresan problar ile etiketlenen proteinler ifade hücreleri.
- Bir mikrosantrifüj tüp, 100 mM KCl 100 mcL ekleyin. Mikropipet ucu kullanarak, donör ve alıcı floresan probları ile etiketlenen proteinler ifade hücrelerinin plaka 3-5 maya kolonileri kazıyın ve bu hücreler ile 100 mM KCl aşılamak.
- 10 mcL hücre süspansiyonu çıkarın ve yeni bir mikroskop lamı üzerine dağıtmak, bir lamel ile damlacık kapağı ve lamel yüzeyinde bir yağ damlacık yerleştirin.
- Lazer ışığı mikroskop hedefine ulaşmasını engellemek için lazer ışını yolunu deklanşör El kapatın.
- Mikroskop amacı damla immersiyon yağı ile temas mikroskop lamı xyz çeviri aşamasına gelene kadar sabitleyin ve slayt / sahne optik ekseni yönünde çevirmek.
- Örnek geniş bir alanda görüntü ciddi emisyon yolu iletim ızgaranın varlığı nedeniyle bulanık olacaktır. Bu nedenle, iletim ızgarası önceki optik yolu küçük bir FWHM bandpass yerleştirin. Geniş alan ışık aydınlatma açın ve veri toplama kamera video moduna gidin. Yavaş yavaş hücreleri odak noktası haline getirilir kadar kamera ekranında hücrelerin görüntü izlerken optik ekseni yönünde çeviri aşamasında çevirmek
- X veya y yönünde tek bir hücre lazer ışınının odak konuma getirmek için iki sahne Çevir.
- Geniş alan aydınlatma kaynağını kapatın. Emisyon yolu bandpass çıkarın.
- CCD dizi alınan sinyal aynı anda izlerken, kısa bir süre (<1 saniye) için lazer ışını engellemesini kaldırın. Floresan sinyal CCD dizi lazer ışını hücre üzerine olay zamanında tespit edilirse, daha sonra bu hücrenin tam bir floresan veri toplama tarama gerçekleştirin. Ca belirlenen aynı tarama parametreleri, özellikle hatları ve y artış sayısı, kullanmak için hayati önem taşımaktadırsalınım prosedürü daha önce gösterdi.
- , Donör etiketleri ve alıcı etiketleri bağlı proteinler ifade hücrelerinin çok sayıda hücre konumu ve floresan veri toplama işlemi tekrarlayın.
- Iki reseptörleri ile etiketlenen proteinler ifade hücrelerinin floresan görüntüler biriken sonra, sadece, alıcı floresan problar ile etiketlenen tek proteinleri ifade donör floresan problar ve hücreler ile etiketlenen proteinler ifade hücreler için tüm işlemi tekrarlayın.
- 3. bölümünde açıklanan yordamı kullanarak, her veri kümesi için Işıksal çözülmesi xy floresan yoğunluğu uzamsal haritalar elde etmek için tüm taramaları yeniden.
5. Görüntü analizi
Xy floresan yoğunluğu uzamsal haritalar, bir floresanlama biyolojik hücrenin tek bir tarama sonucu, her bir piksel, bu belirli bir piksele denk gelen uyarım voksel yaşayan moleküler kompleks tam spektral profili içerir. Ilgi proteinlerin birbiri ile etkileşim varsa, bu spektral profil donör ve alıcı floresan probları gelen sinyalleri bir karışımını içerir. Ilgi proteinler arasındaki etkileşimleri nedenini belirlemek için, bir hücre bu protein kompleksleri çok sayıda spektral profilleri örneklenmiş olmalıdır ve görünen (E app) verimlilik FRET, heyecanlı devletlerin oranı olarak tanımlanan her pikselin FRET üzerinden alıcı floresan prob transfer haline donör floresan prob hesaplanması gerekir.
- Sadece donör floresan problar ile etiketlenen proteinler ifade hücreler için 4. bölümde açıklanan yeniden inşa resimlerin her biri için arka plan düzeltilmiş floresan belirlemek ve maksimum değeri normalleştirmeniz. Bu yeniden inşa edilen görüntülerin her normalize floresan yoğunluğu değerleri bu koleksiyon donör probları ölçülen emisyon spektrumuna karşılık gelen ayrı bir dalga boyu (λ j) karşılık gelir, çünkü i (λ j) D.
- Alıcı probları ölçülen emisyon spektrumunu elde etmek için sadece alıcı floresan etiketleri ile etiketlenen proteinler ifade hücreleri için 1. adımı yineleyin i (λ j). Acceptor probu nadiren doğrudan lazer kaynağı kullanarak heyecanlı olduğu gibi seçilmiş olduğundan, alıcısı sadece örnek kaynaklanan sinyal aynı büyüklük sırasına hücreleri doğasında otofloresans sinyali olarak düşük ve muhtemelen olacaktır. Bu nedenle, bu şekilde hesaplanan ölçülen acceptor floresans spektrumu geçmeden önce otofloresans katkısı kaldırmak için düzeltilmesi gerekir.
- Adım 1 ve 2. adımda elde edilen normalize spektrum kullanarak, spektral ilişki I (λ j) = k DA kullanarak acceptor floresan problar ile etiketlenmiş donör floresan probları ve proteinler ile etiketlenen hem protein eksprese eden hücrelerin floresans emisyon spektrumu her piksel ayrıştırmak i D (λ j) + k AD i A (λ j) I (λ j) floresans spektrumu ölçülen belirli her piksel temsil eder. K DA ve k AD alıcıları varlığı ve sırasıyla donörler, 5 varlığı içinde alıcıları vericilerden floresans emisyon değerleri orantılıdır.
- Formül kullanılarak her pikselin hücre içindeki proteinlerin etkileşim haritalar belirgin FRET verimliliği hesaplayın
. Burada D, Q ve Q donör floresan prob ve alıcı floresan prob kuantum verimi sırasıyla, w-Ge ve w sırasıyla 19, 20, normalize donör ve alıcı emisyon spektrumu integraller . - Son olarak, belirli bir D app değeri oluşur kez E app o belirli değer karşı çizilen her bir piksel, E app hesaplanan değerleri kullanarak bir histogram oluşturmak .
. Burada D, Q ve Q donör floresan prob ve alıcı floresan prob kuantum verimi sırasıyla, w-Ge ve w sırasıyla 19, 20, normalize donör ve alıcı emisyon spektrumu integraller . 6. Histogram Analizi
E uygulaması histogramlar nicel bilgi elde etmek için, her histogram teorik olarak aşağıdaki formüle göre, Gauss fonksiyonları bir miktar uygun: 
,
A i genlik nerede, ben standart sapma σ ve E 0i en muhtemel i i. Gauss fonksiyonu verimliliği FRET. Farklı oligomer boyutuE 0i ve onları 1, 17 arasında farklı korelasyon farklı sayıda (n) lar ve yapılandırmaları yol. Örneğin, bir eşkenar dörtgen şekilli tetramer, beş doruklarına, Tablo 1'de yer alan ifadeler verdiği tahmin edilmektedir.
Tablo 1 her beş Gauss tepe merkezi değerleri ve ikili arasındaki ilişki, bir eşkenar dörtgen şekilli tetramer için öngörülen verimlilik FRET . 
E p karşılık gelen bir - diğer dört E p değeri hesaplanır Bu sadece bir E 0i değeri veri uydurma süreci ayarlanabilir olması gerekir anlamına gelir .
- Oligomer modeli varsayalım ve E uygulaması histogramlar 1 montajında kullanılmak üzere Gauss numarasını belirlemek. E p, A i ayarlayarak Fit histogram ve i σ. Histogramlar göreli eğilim modeli ile sabit olduğunu unutmayın. Uyum ki kare ya da diğer bazı iyilik-of-fit fonksiyonel en aza indirin.
- Başka bir olasılıkla oligomer model ve tekrar adım 1 numara varsayalım.
- Kullanılan parametreler sayısı için veri en uygun modeli seçin. Bu istatistiksel bir test kullanarak (ki kare serbestlik derecesi numarası başına) gerektirebilir.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1'de gösterildiği Steril 2 α-faktörü (Ste2p) 21, 22 ifade eden bir maya hücresidir yapılan Işıksal çözülmesi iki foton mikroskopi ölçümleri bilgisayarlı çıkan k DA, k AD ve E uygulaması uzamsal haritalar.
Şekil 1. Steril 2 α-faktör reseptörü ifade maya hücresidir. Donör (k DA) ve alıcı (k AD) sinyalleri İki boyutlu haritalar Işıksal çözülmesi iki-foton kullanılarak çekilen görüntüler her bir piksel konumunu uygulanan spektral deconvolution prosedürü elde edildi Steril 2 α-faktör reseptörü (Ste2p) ifade eden bir maya hücresidir mikroskop. Floresan şiddetleri yanlış renk değerlerini ve ölçekli bir ek modül olarak gösterilen göre atanır. Belirgin perde verimliliği iki boyutlu harita, k DA ve k AD görüntüleri kullanılarak hesaplanmıştır .
Histogram grafiği Şekil 1'de gösterildiği gibi hücre E uygulaması harita çıkarılan değerler kullanılarak hazırlanmıştır. Şekil 2 Şekil 1'de resmedilen hücre ölçülen E app değerleri (daireler) karşılık gelen donatılmış histogram grafiği resimde. Kırmızı düz çizgi bireysel Gauss fonksiyonları (yeşil katı hat) toplamı ile ölçülen veriler için en uygun temsil eder.
Şekil 2. Steril 2 α-faktör reseptörü ifade eden bir maya hücresidir E app değerleri histogram grafiği, Şekil 1'de resmedilen hücre için E app ölçülen değerler (daireler) karşılık gelen histogram grafiği gösterilmiştir . Bireysel Gauss fonksiyonları (katı yeşil çizgiler) ölçülen değerler (katı kırmızı çizgi) simüle etmek için toplanır. Gauss fonksiyonu parametreler şunlardır: E 01 = 16.7; 1 = 118.9; 1 = 3.2 σ; E 02 = 25.1; 2 = 100.0; σ 2 = 4.6; E 03 = 32.6; 3 = 202,6; σ 3 = 4.6; E 04 = 40.1; 4 = 92.6; 4 = 3.7 σ E 05 = 50.1; 5 = 16.0; 5 = 7.9 σ.
Gauss arasındaki ilişkiler Tablo 1'de verilmiştir Şekil 2 histogram sunulan verilerin sığması için gerekli demektir. Gauss fonksiyonları arasındaki korelasyon sayısı ve numarası ve eşkenar dörtgen şekilli tetramer oligomer kompleksleri için beklenen D uygulaması değerleri arasındaki korelasyon karşılık gelir. Bu nedenle, Ste2p oligomer kompleksi 19 in vivo bir eşkenar dörtgen şeklinde tetramer şeklinde varsayar Işıksal çözülmesi iki foton ölçümler açıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunumda, in vivo bir protein oligomer kompleksi hakkında boyutu ve yapısal bilgiler nasıl belirleneceği gösterilmiştir. Sunulan veriler, maya hücreleri ifade belirli bir membran reseptör (yani Ste2p) elde iken, yöntem herhangi bir hücre tipi, tek şart olarak ifade herhangi bir protein türüne uygulanabilir ki her şeyi kuşatan proteinler Uygun floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol gelecek değişiklikler zamana bağımlı protein oligomer boyutu ve yapısı değişiklikleri izlemek için bir girişimde daha yüksek tarama hızları elde etmek için araç geliştirme içerecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, UW-Milwaukee Araştırma Büyüme Girişimi Wisconsin Enstitüsü, Biyomedikal ve Sağlık Teknolojileri ve Bulut Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , Springer. London. (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
