Biology

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

Published: January 19, 2011 doi: 10.3791/2247

Michael Stoneman¹, Deo Singh¹, Valerica Raicu^1,2

¹Department of Physics, University of Wisconsin - Milwaukee, ²Department of Biological Sciences, University of Wisconsin - Milwaukee

Summary

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

Abstract

המחקר של אינטראקציות חלבון בתאים חיים הוא אזור חשוב של המחקר, כי המידע שהצטבר הן הטבות יישומים תעשייתיים כמו גם מגדיל בסיסי ידע ביולוגי בסיסי. פורסטר (הקרינה) תהודה העברת אנרגיה (סריג) בין מולקולת התורם במצב נרגש אלקטרונית מולקולה acceptor הסמוכים נוצל לעתים קרובות ללימודים של חלבונים אינטראקציות בתאים חיים. החלבונים של עניין מתויגים עם שני סוגים שונים של בדיקות ניאון והביע בתאים ביולוגיים. בדיקות פלורסנט שמחים אז, בדרך כלל באמצעות אור לייזר, ואת המאפיינים הרפאים של פליטת הקרינה הנובעות בדיקות ניאון הוא לאסוף ולנתח. מידע בדבר מידת האינטראקציות חלבון מוטבע נתוני פליטה ספקטרליים. בדרך כלל, התא חייב להיות סרק מספר פעמים על מנת לצבור מידע ספקטרלי מספיק כדי לכמת במדויק את היקף האינטראקציות חלבון עבור כל אזור של אינטרס בתוך התא. עם זאת, את ההרכב המולקולרי של אזורים אלה עשויים להשתנות במהלך תהליך הרכישה, להגביל את הנחישות המרחבית של ערכים כמותיים של סריג היעילות לכאורה בממוצע על פני התאים כולו. באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים spectrally נפתר, אנו מסוגלים להשיג סט מלא של תמונות נפתרה spectrally לאחר הסריקה אחד בלבד להשלים עירור של המדגם של עניין. מכאן פיקסל ברמה נתונים ספקטרליים, מפה של סריג יעילות ברחבי התא מחושב. על ידי יישום תיאוריה פשוטה של סריג מתחמי oligomeric חלוקת שהושגו בניסוי של סריג יעילות ברחבי התא, סריקה החליט spectrally אחד מגלה מידע stoichiometric מבניים על המתחם oligomer תחת מחקר. כאן אנו מתארים את הליך הכנת תאים ביולוגיים (cerevisiae Saccharomyces שמרים) להביע את קולטני קרום (סטרילי 2 α גורם קולטנים) מתוייגים עם שני סוגים שונים של בדיקות ניאון. יתר על כן, אנו ממחישים הגורמים הקריטיים המעורבים באיסוף נתונים באמצעות פלואורסצנציה החליטה spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה במיקרוסקופ. השימוש בפרוטוקול זה ניתן להאריך ללמוד כל סוג של חלבון אשר יכול לבוא לידי ביטוי בתא חי עם סמן פלואורסצנטי קשור אליו.

Protocol

1. פלסמיד עיצוב

החלבונים של עניין הם התמזגו לאחת משתי תוויות ניאון שונה, כמתואר הבא. תוויות ניאון לא רק לספק מידע על מיקום של חלבונים בתוך התא, אלא גם מידע כמותי לגבי הומו-oligomerization של החלבון ^1. הטכניקה של העברת אנרגיה פלואורסצנטי תהודה (סריג) ^2-4 משמש לצבירת מידע על אינטראקציות חלבון ^50-10. סריג מנצל את העיקרון כי העברה של אנרגיה יכול להתרחש מן המולקולה נרגש אופטית (המכונה בדרך כלל כמו התורם, ד) למולקולת נלהבת (המכונה בדרך כלל כמו acceptor, א) דרך אינטראקציות דיפול ^{דיפול-11,} אם שתי מולקולות באים בסמיכות זה לזה. בעיצוב פלסמידים קידוד החלבונים היתוך, שתי תכונות עיקריות יש לזכור, כדלקמן.

בחירת זוג תואם של תגי פלורסנט היא בעלת חשיבות עליונה סריג מחקרים. באופן אידיאלי, את השילוב תג פלורסנט חייב לעמוד בשני קריטריונים: חפיפה ניכרת בין אורכי גל בספקטרום הפליטה של תג התורם את ספקטרום עירור של תג acceptor, ועל הפרדה גדולה בין אורך הגל של הספקטרום מרכז הדופק לייזר ואת ספקטרום עירור של acceptor (כלומר, שינוי גדול סטוקס). שני וריאנטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק ^{12, 13} הם במיוחד גם מתאים לקריטריונים אלה: את ה-GFP ₂ כמו תורם ¹⁴ ו חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ¹² או וריאציה של זה נקרא ונוס ¹⁵ כמו acceptor. Cerulean ¹⁶ יכול לשמש גם תורם, אבל עם תוצאות קצת יותר צנוע.
ב כמותי סריג הדמיה עדיף אם רק אחד תורם במתחם המולקולרי הוא מתרגש בכל פעם (בממוצע), כך התחרות לא מתרחשת בין תורמים להעברת אנרגיה acceptor באותו קומפלקסים המכילים יותר תורם אחד acceptor . זה מוביל הפשטת בתיאוריה וניתוח נתונים ¹⁷ התהליך. משום כך, רמת האות נמוכה בדרך כלל. כדי לפצות על זה, את רמת הביטוי של חלבונים הריבית צריכה להיות גבוהה יחסית. רמות ביטוי גבוהה מושגות באמצעות עותק גבוהה פלסמיד לשאת את הגן החלבון לתוך התא.

2. שמרים שינוי

זהו יתרון על מנת למקסם את אחוז האוכלוסייה תא המבטא את החלבון בונה של עניין. לשם כך, אנו הופכים זן auxotrophic של תאים שמרים (Saccharomyces cerevisiae), מסוגל לייצר טריפטופן או אורציל, עם שני פלסמידים שונים, אחד המכיל את טריפטופן סמן לבחירה אחד אורציל הסמן. פלסמידים מכילים גם את הגנים הנושאות הוראות התא לבטא את החלבון של עניין מתוייגים עם אחת משתי בדיקות ניאון. התאים הפכו גדלים על צלחות בינוני מוצק אשר גם חוסר טריפטופן ו אורציל. לפחות שלושה סוגים של תאים צריך להשתנות: תאים המבטאים את החלבונים עניין מתוייגים עם שני סוגי בדיקות פלורסנט, תאים לבטא חלבונים בלבד מתוייגים עם בדיקות התורם תאים פלורסנט לבטא חלבונים בלבד מתוייגים עם בדיקות ניאון acceptor.

הכינו צלחות בינוני מוצק (1.7 גרם / L של חנקן שמרים בסיס w / o חומצות אמינו, 1.6 גר '/ L שמרים סינתטיים הנשירה בינוני w / o אורציל ו טריפטופן, 2% [w / v] גלוקוז, 2% [w / v] אגר) לשמש כמדיום הצמיחה עבור התאים הפכו לפחות יום אחד לפני הפיכת התא. הצלחות בינוני מוצק יכול לשמש עד חודשיים לאחר הכנה אם הם נותרים ללא כל זיהום.
עבור כל זוג פלסמיד להשתנות, להוסיף 10 מ"ל של YPD (10 g / L Bacto תמצית שמרים, 20 גרם / L Bacto Peptone, ו -2% [w / v] גלוקוז) על בקבוק erlenmeyer. Incoluate YPD עם מושבה של המתח auxotrophic של תאים שמרים להשתנות.
מניחים את הבקבוק erlenmeyer המכיל את התרבות השמרים שייקר מעבדה, אשר מספק פעולה מתערבל מסלולית על דגימות, ואת דגירה לילה בשעה 30 ° C. למחרת בבוקר, להתחיל לפקח על צמיחה של התרבות התא מעת לעת על ידי הסרת נפח קטן של תרבות בדיקות צפיפות אופטית שלה (OD). הצמיחה של התרבות התא צריך להיות בשלב אמצע לוגריתמי, כלומר OD של 0.5-1.0, במועד השינוי.
הפקדה 5 μL של שני סוגי פלסמידים לתוך צינור microcentrifuge סטרילי עבור כל זוג פלסמיד להשתנות.
עבור כל זוג פלסמיד להשתנות, להוסיף 5 μL של ה-DNA סלמון זרע (5 מ"ג / מ"ל) אל צינור microcentrifuge ריק. לצלול התחתון של הצינור microcentrifuge DNA המכיל את הזרע סלמון במים רותחים במשך חמש דקות. כדי למנוע את הכובע של הצינור microcentrifuge מן אופ פקיעהen, לצלול רק את החצי התחתון של הצינורות microcentrifuge במים. לאחר הסרת מן המים הרותחים, במקום צינור microcentrifuge DNA המכיל זרע סלמון בקרח במשך לפחות שתי דקות.
הוסף 5 μL של ה-DNA זרע סלמון על כל שפופרת המכילה microcentrifuge פלסמידים.
מדוד את OD של התרבות השמרים גדל כדי לוודא שהוא הגיע באמצע שלב לוגריתמי (כלומר קריאה OD בין 0.5 ו - 1.0).
צנטריפוגה ההשעיה שמרים ב 1000xg במשך שתי דקות.
יוצקים את supernatant ו resuspend את השמרים במים גלולה deionized עיקור באמצעות מערבל מערבולת.
צנטריפוגה ההשעיה שוב בבית 1000xg במשך שתי דקות.
בטל supernatant ו resuspend גלולה בתמיסה של 0.1M LiOAc ב TE (1.02 גרם LiAc, 10 מ"ל של 1M טריס ב-pH 7.4, 0.1 ו - 10 מ"ל EDTA M ב-pH 8.0). נפח 0.1M LiOAc ב TE צריך להיות שווה ^ה 1 / 100 של נפח תרבות המקורי השמרים YPD.
הפץ 100 μL של תאים לכל אחד הצינורות microcentrifuge המכיל את פלסמידים. פליק כל הצינור בעדינות כדי לערבב את תאים עם פלסמידים.
הוספת 400 μL של 44% [w / v] פוליאתילן גליקול (PEG ₄₀₀₀₎ פתרון לכל אחד הצינורות microcentrifuge.
בעדינות מערבבים את PEG ₄₀₀₀ עם תאים פלסמידים. כדי למנוע שבירת תאים, אין להשתמש במערבל מערבולת בשלב זה. כדי לערבב בעדינות, מחזיקים את המכסה microcentrifuge והחלק התחתון של הצינור microcentrifuge בין האצבע לאגודל, לאט להפוך את הצינור, ואז לאט לאט להביא את הצינור בחזרה למצב זקוף. סובב את הצינור 90 ° על ציר גלילי שלה ולאט לאט להפוך שוב. חזור על תהליך זה מספר פעמים, כך התאים להחליק את שטח הפנים של כל הקירות של הצינור microcentrifuge.
מניחים את צינורות microcentrifuge ב 30 מעלות באינקובטור במשך 45 דקות.
לאחר דגירה 45 דקות, להסיר את התאים מן החממה לחזור על התהליך המתואר ערבוב עדין 14.
מניחים את צינורות microcentrifuge באמבט 42 מעלות מים דגירה במשך 15 דקות. שוב, רק להטביע את החצי התחתון של הצינורות microcentrifuge במים.
לאחר דגירה 42 °, להוסיף 1 מ"ל של מים deionized עיקור של חצוצרות microcentrifuge.
צנטריפוגה צינורות microfuge השולחן למשך 5 שניות. הסר את supernatant מן הצינורות באמצעות micropipetter.
הוספת 100 μL מים deionized עיקור לכל אחד הצינורות microcentrifuge מערבבים את המים deionized מעוקר עם התאים באמצעות תהליך ההיפוך.
הוסף את תוכנו של צינור microcentrifuge יחיד צלחת צמיחה בינוני אשר בוחר עבור פלסמידים בפרט הוסיף הצינור microcentrifuge. הוספת 4-6 חרוזי זכוכית מעוקר (1 מ"מ קוטר). לנער את הצלחת המכיל את אגל של תאים שמרים הפכה וחרוזי זכוכית כדי שתאי מפוזרים על פני השטח של מדיום הגידול אגר. חזור על תהליך זה עבור כל קבוצה של התאים להשתנות.
מניחים את הלוחות 30 ° בחממה במשך 3 - 5 ימים. לאחר 3-5 ימים, מושבות שמרים מרובים בקוטר 1-3 מ"מ יהיה גלוי על פני השטח של מדיום הגידול. בשלב זה, התאים מוכנים להיות הדמיה מיקרוסקופ שני הפוטונים החליט spectrally.

3. כיול החליטה spectrally שני הפוטונים מיקרוסקופ

נפתר spectrally שני הפוטונים מיקרוסקופ המשמש במחקרים אלה תוארה בפירוט במקום אחר ^{18, 19.} בקצרה, הספק גבוה של מצב מוצק לייזר גל רצוף משמש משאבה במצב נעול-Ti: לייזר ספיר אשר מייצר פולסים femtosecond של אורכי גל הנעים בין ~ 750-830 ננומטר. קרן לייזר ממוקדת מטרה ידי NA גבוה מיקרוסקופ כדי לזהות עקיפה מוגבל על המדגם. עירור מתרחשת רק באזור מוקד ליד הקורה בגלל ההסתברות הנמוכה של עירור שני הפוטונים. צמד של מבוקרת מחשב מראות אורתוגונליים סריקה משמשים לתרגם את המיקוד של הקורה בתוך המטוס המדגם בשני כיוונים שונים (המכונה בכיוונים x ו-y בכל פרוטוקול). פליטת גב הפצת הקרינה מן voxel מואר של המדגם הוא מפוזר למרכיבים ספקטרלי על ידי צורמת שידור להציב בדרכו של פליטת לפני שהאור נופל האירוע על גבי פיקסלים של מערך EM-CCD. כך, הפרופיל ספקטרלי מלא של מולקולת כל / מולקולות ניאון בתוך האזור מוקד של הקורה מתקבל לאורך ממד אחד (בכיוון y) של מערך ה-CCD. באמצעות תנועה של אחת משתי מראות סריקה, מיקום המוקד לייזר ניתן לסרוק בתוך המדגם לאורך קו מאונך לכיוון Y. על ידי שמירה על תריס של מצלמה CCD לפתוח במהלך סריקה זו שורה אחת, את הפרופילים ספקטרלי של מיל מולקולות ניאוןiding לאורך קו שלם של הסריקה נאספים לטאטא אחת של קרן לייזר על פני המדגם. צבירת סריקות קו מרובים מסוג זה במקומות y שונות בתוך התא נותן את הפרופילים הרפאים של מספר רב של מתחמי פלורסנט המתגוררים בתוך המדגם. הדימויים שהתקבלו סריקות קו משוחזרים לתת מרובים עוצמת הקרינה xy מפות המרחבי של המדגם באורכי גל שונים ^{18, 19.} כדי לשחזר במדויק ולחשב את אורך הגל המתאים בפועל המפות פלורסנט xy עוצמת מרחבית, פרוטוקול סריקה קו חייב להיות מכויל באמצעות דגימת עם ספקטרום היטב מאופיין פליטת הקרינה.

החליטה spectrally שני הפוטונים מיקרוסקופ מצטבר מידע ספקטרלי על מתחמי oligomer בתא הדמיה על ידי סריקת מוקד הקורה עירור על מדגם של עניין במספר מוקדים.
זוג מראות סריקה אורתוגונליים משמש לתרגם את המיקוד של אלומת הלייזר על פני המדגם בשני כיוונים שונים. תנועת המראות הסריקה המחשב מבוקרת מסונכרן עם החילוץ של נתונים עוצמת הקרינה מן המצלמה CCD.
מתוך סריקות קו, מפות עוצמת פלורסנט מרחבי המתאים באורך גל מסוים של אור ניתן לשחזר. כדי לשחזר במדויק מפות xy עוצמת פלורסנט מרחבית לחשב את אורך הגל המתאים לכל אחד בפועל של מפות אלו, הפרוטוקול סריקה קו חייב להיות מכויל באמצעות פתרון והעמסת.
כדי להתחיל את הליך כיול, במרכז ספקטרום עירור באורך גל של 800 ננומטר, אשר 2X אורך הגל המרבי של עירור תג התורם, GFP _2. כדי למרכז את ספקטרום עירור, לתרגם את פריזמה ממוקם בתוך חלל לייזר כדי לשנות את פיזור מהירות החבורה. פריזמה מותקן במחשב מבוקר שלב ממונע ליניארי.
באמצעות תוכנת מחשב המצלמה היא interfaced, שלח פקודה שבב CCD להנמיך את הטמפרטורה של שבב ה-CCD לטמפרטורה הנמוכה ביותר שניתן להשיג על מנת להפחית את הרעש כהה.
פיפטה 10 μL של פתרון והעמסת לשקופית מיקרוסקופ. מכסים coverslip כך שכבה דקה של המדגם הוא מפוזר באופן אחיד באזור בין coverslip לבין שקופיות מיקרוסקופ.
המקום טיפה קטנה של שמן טבילה על פני השטח של coverslip
עכשיו להדק את השקופית מיקרוסקופ לשלב את התרגום xyz ולתרגם את השקופית / שלב בכיוון ציר אופטי באופן ידני על ידי התאמת מפעיל ליניארי אשר שולטת על התנועה שלב בכיוון ציר אופטי. תרגם את השקופית / שלב עד המטרה מיקרוסקופ בא במגע עם טיפה של שמן טבילה.
באמצעות תוכנת מחשב אשר שולטת על המצלמה, לעבור למצב וידאו של רכישת נתונים ולכן האור הנפלט מכה את מערך ה-CCD מוצג על מסך המחשב בזמן אמת. לאט לאט, להתאים את מיקרומטר שליטה על הבמה תרגום בכיוון ציר אופטי להביא את המדגם לתוך המקום מוקד של קרן לייזר.
כאשר המדגם והעמסת הוא בפוקוס, פליטת יופיע כקו חדה על מערך ה-CCD. הורד את readout של עוצמות פיקסל מהמערך CCD אל המחשב באמצעות תוכנת מחשב לשליטה במצלמה. מדוד את עוצמת הפיקסל כפונקציה של המיקום על מערך ה-CCD ידי פתיחת מטריצה הורדת ערכי העוצמה ב-J תמונה ציור קו באמצעות באזור ניאון. השתמש בפקודה J תמונה נתח → פרופיל מגרש ליצור עלילה הממחישות את ספקטרום הפליטה של המדגם והעמסת.
התאם את פרמטר מצטבר של המראה השולט על תנועת למקד את הלייזר בכיוון y, כך עמדות y סמוכים בתוך התוצאה מדגם בתנועת שיא של ספקטרום הקרינה בפיקסל אחד בדיוק לאורך המימד ספקטרלי על CCD המערך. צג זה על ידי הורדת עוצמת ספקטרום והעמסת תמונה ערך עבור שתי עמדות שונות y במדגם, פתיחת תמונות אינטנסיביות עם J תמונה, ולמצוא את עמדת פיקסל שיא עבור כל ספקטרום הקרינה באמצעות הסמן J תמונה.
השארת תריס של לפתוח CCD, סריקה מוקד לייזר על פני המדגם בכיוון x. האור הנפלט voxel כל קו הסריקה צריך ליפול האירוע על מערך ה-CCD.
אחסן את הנתונים במערך CCD שהתקבלו לסרוק את הקו הזה ולאחר מכן נקה את פיקסלים של מערך ה-CCD.
העבר את המיקום של הפוקוס לייזר בכיוון y בסכום שנקבע בשלב 11 של סעיף זה.
סרוק את קרן הלייזר לכיוון x על פני המדגם, שוב עוזב לפתוח את התריס של ar-CCDray ו לאחסן את הנתונים.
חזור על נוהל זה עד אזור קו סריקה פיזית ~ 50% יותר מאשר את הממדים של תא ביולוגי בודד כבר מואר על ידי אור לייזר.
הקשר בין מספר השורה של תמונה קו מסוים לסרוק הגל יש להשתמש כדי לשחזר את התמונות כדי לקבל מספר פלורסנט xy עוצמת מפות מרחבי באורכי גל שונים. כדי להשיג את התמונה פלואורסצנציה xy הפליטה באורך גל מסוים (λ _j), למצוא את מספר השורה על התמונה המתקבלת לסרוק את השורה הראשונה המתאימה הגל הזה. אז את השורה הסמוכה התמונה קו הבאים לסרוק מתאים לשורה הבאה של התמונה פליטת הקרינה של אורך הגל המסוים הזה. סטאק את כל השורות תמונה שמתאימים גל זה כדי לקבל את המפות פלורסנט xy עוצמת המרחבי של המדגם באורך גל זה. חזור על הליך זה עבור כל אורכי הגל השגה אחרים.
כדי לחשב את אורך הגל קשורה כל מפה xy ניאון בעוצמה מרחבית, לקבוע רקע תיקון עוצמת הקרינה מנורמל של כל תמונה המשוחזר כפונקציה של מדד תמונה (י). הקשר בין מיקום המצלמה פיקסל בממד רפאים אורך הגל של הפוטונים הנפלטים היא ליניארית בקירוב, ולכן הקשר בין המשוחזר פלורסנט xy עוצמת הדימויים מפה מרחבית אורך הגל המתאים גם ליניארי מחושב באופן הבא:
איפה הערך של מ 'מיוצגת על ידי:
ב הפורמליזם לעיל, סמל λ _j מייצג את אורך הגל של התמונה ^ה j משוחזר. ערכים של λ _max ו λ _½ המחולצים ספקטרום פליטה של המדגם והעמסת, ומתאימים את אורכי הגל בו עוצמת הקרינה של המדגם fluorescing הוא מקסימום חצי מקסימלית, בהתאמה. מדדי התמונה j ו j _{מקסימום ½} מתאימות את התמונות משוחזר בעל עוצמת הקרינה המקסימלית ואת מחצית המקסימום, בהתאמה.

4. איסוף נתונים על דגימות ביולוגיות של עניין

כדי לאסוף נתונים על דגימות שלך, להסיר תחילה מן האינקובטור צלחות עם מושבות שמרים טרנספורמציה. לא צריך להיות לפחות שלושה סוגים של תאים הפך ברוחב מלא למחצה לכל היותר (FWHM):
1. תאים המבטאים את החלבונים עניין מתוייגים עם שני סוגי בדיקות ניאון
2. תאים לבטא חלבונים בלבד מתוייגים עם בדיקות התורם ניאון, ו
3. תאים לבטא חלבונים בלבד מתוייגים עם בדיקות ניאון acceptor.
הוספת 100 μL של KCl 100 מ"מ לצינור microcentrifuge. בעזרת קצה micropipette, לגרד 3-5 מושבות שמרים את הצלחת של תאים לבטא החלבונים המתויגים עם התורם והן בדיקות ניאון acceptor ו לחסן 100 מ"מ KCl עם תאים אלה.
הסר 10 μL ההשעיה התא ומוציאים אותו בשקופית מיקרוסקופ טריים, לכסות את אגל עם coverslip, והמקום טיפה של שמן על פני השטח של coverslip.
ידנית לסגור את התריס בנתיב של קרן לייזר כדי לחסום את אור לייזר מלהגיע אובייקטיבי מיקרוסקופ.
הדקו את השקופית מיקרוסקופ לשלב את התרגום xyz ולתרגם את השקופית / שלב בכיוון ציר אופטי עד אובייקטיבי מיקרוסקופ בא במגע עם טיפה של שמן טבילה.
התמונה בתחום רחב של המדגם יהיה מטושטש קשה בגלל נוכחות של הסורג שידור בנתיב פליטה. לכן במקום מסנן bandpass עם FWHM קטן בדרך אופטי שקדמו צורמת השידור. הפעלת התאורה בשטח רחב האור, לעבור למצב את מצלמת הווידיאו של איסוף נתונים. לאט לאט לתרגם את שלב התרגום בכיוון ציר אופטי בעת הצגת תמונה של תאים על גבי מסך המצלמה עד התאים מובאות למיקוד
תרגם את הבמה או את x או y הכיוון כדי להביא תא בודד למיקום של מוקד קרן הלייזר.
כבה את מקור תאורה רחב בתחום. הסר את מסנן bandpass מדרך פליטה.
הסרת החסימה של קרן הלייזר למשך זמן קצר (<1 שנייה), ובמקביל להציג את האות קיבלו על מערך ה-CCD. אם אות ניאון הוא זוהה על מערך ה-CCD בזמן את קרן הלייזר הוא האירוע על התא, ולאחר מכן לבצע סריקה נתונים מלא הקרינה הרכישה של התא הזה. זה חיוני להשתמש פרמטרים סריקה אותו, במיוחד מספר קווים תוספת y, כפי שנקבע ב caהליך libration הפגינו מוקדם יותר.
חזור על מיקום התא תהליך נתוני הקרינה רכישת מספר גדול של תאים לבטא חלבונים המצורפת תגיות הן התורם התגיות acceptor.
לאחר צבירת תמונות פלואורסצנציה של תאים לבטא החלבונים המתויגים עם שני קולטנים, חזור על התהליך עבור שני תאים לבטא חלבונים בלבד מתוייגים עם בדיקות התורם תאים פלורסנט לבטא חלבונים בלבד מתוייגים עם בדיקות ניאון acceptor.
באמצעות ההליך המתואר בסעיף 3, לשחזר את כל סריקות כדי להשיג פתרון spectrally מפות xy עוצמת מרחבי ניאון עבור כל קבוצה של נתונים.

5. ניתוח תמונה

כל פיקסל של מפות פלורסנט xy עוצמת מרחבית, אשר כתוצאה סריקה בודדת של תא ביולוגי fluorescing, מכיל את פרופיל ספקטרלי מלא מורכב המולקולרית המתגוררים voxel עירור המתאים פיקסל מסוים. אם את החלבונים עניין נמצאים באינטראקציה אחד עם השני, זה פרופיל ספקטרלי יכיל תערובת של אותות מתורם והן בדיקות ניאון acceptor. על מנת לקבוע את אופי יחסי הגומלין בין החלבונים של עניין, הפרופילים ספקטרלי ממספר רב של קומפלקסים חלבונים אלו בתוך התא חייב להיות שנדגמו לכאורה סריג יעילות (E _App), כמוגדר בשיעור של מדינות מתרגש בדיקה של התורם ניאון להיות מועברים החללית פלורסנט acceptor דרך סריג, של כל פיקסל צריך להיות מחושב.

קבע את הרקע לתיקון עוצמת הקרינה של כל אחד תמונות משוחזר המתואר בסעיף 4 עבור תאים להביע החלבונים המתויגים רק עם בדיקות התורם פלורסנט לנרמל לערך המקסימלי. בגלל כל אלה תמונות המשוחזר מתאים גל נפרד (λ _j) זה אוסף של מנורמל ערכי עוצמת הקרינה המתאים ספקטרום הפליטה נמדד של בדיקות התורם, אני ^D (λ _j).
חזור על שלב 1 עבור תאים להביע החלבונים המתויגים רק עם תגי פלורסנט acceptor לקבל את ספקטרום הפליטה נמדד של בדיקות acceptor, אני (λ _j). מאז בדיקה acceptor נבחר כזה הוא נדיר נרגש ישירות באמצעות מקור לייזר, האות הנובעות דגימות רק acceptor יהיה נמוך ואולי על באותו סדר גודל כמו האות התאים autofluorescence הטבועה. לכן, ספקטרום הקרינה הנמדד acceptor מחושב בצורה זו ייתכן שיהיה צורך לתקן להסיר את התרומה של autofluorescence לפני שתמשיך.
שימוש בספקטרום מנורמל שהושגו בשלב 1 ובשלב 2, spectrally לפרק כל פיקסל של ספקטרום פליטת הקרינה של תאים לבטא הן החלבונים המתויגים עם בדיקות התורם חלבוני ניאון מתוייגים עם בדיקות ניאון acceptor באמצעות היחס אני (λ _j) = k ^DA אני ^D (λ _j) + k ^מודעה (λ _j) שבו אני (λ _j) מייצג כל פיקסלים מסוים נמדד ספקטרום הקרינה. הערכים של k ו k ^{התובע לספירה} הם יחסי פליטת הקרינה מתורמים בנוכחות acceptors מ acceptors בנוכחות התורמים, בהתאמה ^5.
חשב את היעילות לכאורה סריג הממפה את האינטראקציה של חלבונים בתא כל פיקסל באמצעות הנוסחה, . כאן, ש ^D ו-Q הם התשואות הקוונטי של בדיקה התורם ניאון ניאון בדיקה acceptor בהתאמה, ^D ו-W w הם אינטגרלים של התורם מנורמל ופליטה ספקטרום acceptor, בהתאמה ^{19, 20.}
לבסוף, ליצור היסטוגרמה באמצעות ערכים מחושבים של _יישום דואר עבור כל פיקסל, כאשר מספר פעמים ערך מסוים _יישום דואר מתרחש זממו נגד ערך מסוים של ה _app.

6. היסטוגרמה ניתוח

כדי לחלץ מידע כמותי מן _היישום E היסטוגרמות, היסטוגרמה כל תיאורטית בקנה אחד עם סכום של פונקציות גאוס, על פי הנוסחה הבאה:
משוואה 4 ,
איפה _אני נמצא את המשרעת, _אני σ סטיית התקן, ועל _0i E הסבירה ביותר סריג היעילות של הפונקציה אני גאוס ^ith. Oligomer שונים גודלשל תצורות להוביל מספרים שונים (n) של _0i E ו מתאמים שונים בין ^{1 אותם, 17.} למשל, עבור tetramer בצורת מעוין, חמש פסגות הם חזו, שניתן על ידי ביטויים המופיעים בטבלה 1.

טבלה 1. הקשר בין כל אחד מחמשת הערכים גאוס שיא מרכז pairwise סריג יעילות ניבאו tetramer בצורת מעוין.

כלומר ערך אחד בלבד E _0i צריך להיות מותאם בתהליך של נתונים מתאים - אחד המתאים E _p - בעוד ארבעת האחרים מחושבים מתוך ערך _ה-p.

נניח מודל oligomer ולזהות את מספר Gaussians לשמש הולם את _היישום E היסטוגרמות ^1. התאמת היסטוגרמה ידי התאמת E _{p, i,} ו - σ _i. ראוי לציין, כי אופי היחסי של היסטוגרמות קבוע על ידי המודל. מזער את הריבוע של צ'י מתאים או אחרת לאל-of-התאמה פונקציונלית.
נניח מודל אחר oligomer סביר וחזור על שלב מספר 1.
בחר את דגם המתאימים ביותר את הנתונים עבור מספר פרמטרים המשמשים. זה עשוי לדרוש בעזרת בדיקה סטטיסטית (כגון הכיכר צ'י לכל מספר דרגות חופש).

נציג תוצאות

באיור 1 הם ^התובע כתוצאה k, k ^{לספירה,} ו-E מפות _{האפליקציה} מרחבי מחושב מתוך שני הפוטונים מדידות החליט spectrally מיקרוסקופית שבוצעה על תא שמרים המבטא את 2 סטרילי α-factor (Ste2p) ^{21, 22.}

באיור 1. תא שמרים להביע הסטרילי 2 α-factor receptor. דו מימדי מפות של התורם (k ^DA) ו acceptor (k ^{לספירה)} אותות התקבלו בהליך deconvolution ספקטרלי להחיל את מיקום כל פיקסל של תמונות שצולמו באמצעות החליט spectrally שני הפוטונים מיקרוסקופ של תא שמרים ביטוי סטרילי 2 α-factor receptor (Ste2p). עוצמות הקרינה מוקצים צבעים כוזב על פי הערכים שלהם ואת היקף מוצג הבלעה. מפה דו ממדית של לדאוג היעילות לכאורה חושבו בעזרת ^התובע k ו k תמונות ^{לספירה.}

העלילה היסטוגרמה הוכן באמצעות הערכים שחולצו מן המפה _app E של התא שמוצג באיור 1. בתמונה באיור 2 היא מזימה היסטוגרמה מצויד המתאים _יישום הערכים שנמדדו E (חוגים) של התא בתמונה באיור 1. קו מוצק אדום מייצג את ההתאמה הטובה ביותר לנתונים שנמדדו באמצעות סכום פונקציות הפרט גאוס (קווים ירוקים מוצק).

איור 2. העלילה היסטוגרמה של ערכי E _{האפליקציה} עבור תא שמרים המבטא את ועיקור 2 α-factor receptor. העלילה ההיסטוגרמה אשר תואמת את הערכים שנמדדו (עיגולים), _המונה E עבור התא בתמונה באיור 1 מוצגת. הפרט פונקציות גאוס (קווים ירוקים מוצק) מסוכמים כדי לדמות (קו אדום מוצק) הערכים שנמדדו. פרמטרים גאוס פונקציה הם: E ₀₁ = 16.7; ₁ = 118.9; σ ₁ = 3.2, E ₀₂ = 25.1; ₂ = 100.0; σ ₂ = 4.6, E ₀₃ = 32.6; ₃ = 202.6; σ ₃ = 4.6; E ₀₄ = 40.1; ₄ = 92.6; σ ₄ = 3.7, E = 50.1 _{05: 5} = 16.0; σ ₅ = 7.9.

היחסים בין גאוס האמצעים הנדרשים כדי להתאים את הנתונים המובאים היסטוגרמה של איור 2 ניתנות בטבלה 1. המספר המתאם בין פונקציות גאוס המתאים למספר ואת המתאמים בין צפוי _יישום ערכי E עבור מעוין מתחמי oligomer בצורת tetramer. לכן, ברור משני פוטון מדידות החליט spectrally כי מורכבות oligomer Ste2p לובש צורה של tetramer בצורת מעוין in vivo ^19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במצגת זו, הדגמנו כיצד לקבוע את גודל מידע מבניים מורכבים על חלבון oligomer in vivo. בעוד הנתונים שהוצגו התקבל קולטן קרום מסוים (כלומר Ste2p) הביע בתאי שמרים, השיטה היא חובקת כל בכך שהוא יכול להיות מיושם על כל סוג של חלבון לידי ביטוי לכל סוג של תא, התנאי היחיד הוא בכך את החלבונים מתויגים עם סמנים ניאון המתאים. שינויים עתידיים לפרוטוקול זה יהיה כרוך בשיפור כלי כדי להשיג מהירויות סריקה גבוהה יותר בניסיון לפקח תלוי זמן oligomer חלבון גודל ושינויים במבנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת UW-מילווקי המחקר צמיחה, המכון ויסקונסין ביו טכנולוגיות הבריאות, קרן ברדלי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH₄)₂SO₄ and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope