Summary
通过采用一个光谱分辨的双光子显微成像系统，像素级别的地图福斯特共振能量转移（FRET）效率得到表达假设形成同源寡聚体复合物的膜受体细胞。从FRET的效率图，我们正在研究能够估计约低聚物复杂的化学计量信息。
Abstract
在活细胞内蛋白质相互作用的研究是一个重要的研究领域，因为这些信息积累了双方利益的工业应用，以及增加基本的生物知识。福斯特（荧光）共振能量转移（FRET）技术已被捐助者之间的电子激发态的分子和附近的受体分子经常利用在活细胞内蛋白质相互作用的研究。感兴趣的蛋白质，是两个不同类型的荧光探针标记，并在生物细胞中表达。然后兴奋的荧光探针，通常用激光，和排放所产生的荧光探针的荧光光谱特性被收集和分析。有关蛋白质相互作用的程度信息嵌入在光谱的排放数据。通常情况下，细胞必须被扫描的次数，以积累足够的光谱信息准确量化地区的每一个细胞内的利益的蛋白质相互作用的程度。然而，这些地区的分子组成，在收购过程中可能会发生变化，限制了明显的FRET效率的定量值平均在整个细胞空间的决心。通过一个光谱分辨的双光子显微镜，我们能够获得利益的样本只有一个完整的激励扫描后的光谱解析影像的全套。从这个像素级的光谱数据，一个地图FRET整个细胞的效率计算。通过运用一个简单的理论低聚复合物的FRET实验获得的分配的FRET效率在整个细胞，单次扫描光谱解决，揭示正在研究有关的计量和结构低聚物复杂的信息。在这里，我们描述生物细胞 （酿酒酵母）表达两个不同类型的荧光探针标记的膜受体（无菌2α-因子受体）的准备过程。此外，我们说明了使用荧光光谱解决双光子显微成像系统数据收集所涉及的关键因素。使用此协议的可扩展研究可以在与它连接到一个荧光标记的活细胞中表达的任何类型的蛋白质。
Protocol
1。质粒设计
感兴趣的蛋白质融合两种不同的荧光标记，如下所述。荧光标记不仅提供有关细胞内的蛋白质的位置，而且还蛋白 1的同源齐聚定量信息的信息。荧光共振能量转移（FRET）2-4技术是用来积累有关的蛋白质相互作用5-10的信息。 FRET技术利用能量转移的原则，可以从光激发态分子（通常称为捐助，D）会出现一个平淡的分子（通常称为受体，一个通过偶极-偶极相互作用的 ）11，如果两个分子来在彼此接近。在设计编码的融合蛋白的质粒，应牢记两个关键特征，如下：
- FRET技术研究的最重要的是选择一个对荧光标记的兼容。理想的情况下，荧光标记的组合必须满足两个条件：捐助标签的发射光谱，激发光谱和受体标记，和大量的激光脉冲频谱的中心波长和激发光谱之间分离的波长之间的一个明显的重叠承兑人（即Stokes位移大）。绿色荧光蛋白12的两个变种中 ，有13个是特别适合于满足以下条件：作为一个捐助者14和黄色荧光蛋白（YFP）12或它的一个变种，叫金星作为承兑人15的绿色荧光蛋白2。西鲁林16也可以被用来作为捐助者，但与较为温和的结果。
- 在定量的FRET成像，它是最好的，如果只有一个在分子复杂的捐助很高兴在一段时间（平均），没有竞争，使捐助者之间发生的转移能量相同的受体复合物，包含多个捐助者之一受体。这将导致在简化的理论和数据分析的过程17。正因为如此，信号电平通常较低。为了弥补这一点，感兴趣的蛋白质表达水平应该是比较高的。实现使用高拷贝质粒携带进入细胞蛋白基因的高表达水平。
2。酵母转化
它有利于最大限度地提高利益表达的蛋白质结构的细胞人口的百分比。为此，我们改变酵母细胞（ 酿酒酵母 ），无法生产色氨酸或尿嘧啶，两种不同的质粒，一个包含选择标记的色氨酸和一个标记尿嘧啶营养缺陷型菌株。还含有质粒的基因进行细胞的指示表达蛋白与两个荧光探针标记的利益。其中也不乏色氨酸和尿嘧啶的固体培养基平板上生长转化细胞。应转变至少有三种类型的细胞：细胞表达的蛋白质利益与荧光探针，只与捐助表达与受体的荧光探针标记只蛋白质荧光探针和细胞标记的蛋白质表达这两种类型的标签。
- 准备固体培养基平板（1.7 g / L的W / O型酵母氮基氨基酸，1.6克/ L酵母合成辍学中期W / O尿嘧啶和色氨酸，2％W / V]葡萄糖，2％W / V]琼脂）作为转化细胞的生长介质中至少前一天的细胞转化。固体培养基板可用于配制后两个月，如果他们仍然无任何污染物。
- 对于每个质粒对进行改造，添加10毫升锥形瓶中YPD（10 g / L的细菌用的酵母提取物，20 g / L的细菌用胰蛋白胨，2％W / V] [葡萄糖）。 Incoluate与转化酵母细胞的营养缺陷型菌株的殖民地的YPD。
- 放入含有酵母培养物在实验室振动筛，它提供了一个轨道上的样品纷飞行动的锥形瓶中，孵育过夜30 ° C.翌日清晨，开始监测定期取出体积小，细胞培养的生长文化和测试其光密度（OD）。应在中期对数生长期的细胞培养的增长，即0.5-1.0 OD，在转型的时间。
- 存款5μL到无菌的离心管中，每个质粒对两种类型的质粒进行改造。
- 对于每个质粒对进行改造，添加5μL鲑鱼精子DNA（5毫克/毫升）的一个空的离心管。淹没含有鲑鱼精子DNA在沸水中5分钟的离心管底部的一半。为了防止弹出运算的离心管中的第EN，只能淹没在水中的微量离心管底部的一半。从沸水中取出后，将包含在冰至少两分钟的鲑鱼精子DNA的离心管。
- 5μL鲑鱼精子DNA添加到每个微量离心管中含有质粒。
- 日益增长的酵母培养物的OD测量，以确认它已达到对数生长期中期（即外径0.5和1.0之间的读数）。
- 两分钟，在1000xg离心酵母悬浮液。
- 倒掉上清，重悬的酵母沉淀在灭菌去离子水使用旋涡混合器。
- 在1000xg离心再次暂停两分钟。
- 弃上清，悬浮在TE在解决0.1M LiOAc颗粒（LiAc 1.02克，10毫升1M的Tris在pH 7.4和10毫升0.1 M EDTA在pH值8.0）。 0.1M LiOAc在TE量应等于原酵母在YPD培养体积的1 / 100次。
- 100μL细胞分发到每个含有质粒的微量管。弗里克每个管轻轻以混合质粒的细胞。
- 加入400μL44％W / V]聚乙二醇PEG（4000）解决方案的每个离心管。
- 轻轻地混合细胞和质粒的PEG 4000 。为了避免破坏细胞，在这一点上不使用旋涡混合器。要轻轻混匀，保持离心帽和食指和拇指之间的离心管底部，慢慢地倒置管，然后慢慢把管回到直立位置。其圆柱轴管90 °旋转，慢慢地再次反转。重复此过程，许多倍，使细胞的整个表面积的离心管中的墙壁滑下。
- 在30℃培养箱中放置45分钟的离心管。
- 孵育45分钟后，从孵化器中取出的细胞，并重复温柔的混合程序描述14。
- 离心管中，并放置在42℃水浴孵育15分钟。再次，只能淹没在水中的微量离心管底部的一半。
- 42 °孵化后，灭菌去离子水加入1毫升的离心管。
- 离心机在5秒钟的桌面离心管。取出使用micropipetter管上清液。
- 每个离心管，加入100μL灭菌去离子水混合使用反演过程的细胞去离子水的消毒。
- 将单一的离心管中的内容添加到该的离心管中的特定质粒选择的增长中厚板。新增4-6灭菌玻璃珠（直径1毫米）。摇板含有细胞在琼脂生长介质表面传播的转化的酵母细胞和玻璃珠液滴。重复这个过程中，每个转化细胞集。
- 板放置在30℃培养箱3 - 5天。经过3-5天，1-3毫米直径的多种酵母菌菌落的生长介质表面上可见。此时，细胞的光谱分辨的双光子显微镜成像。
3。校准的光谱分辨的双光子显微镜
光谱解决在这些研究中所使用的双光子显微镜详细介绍了已在别处 18 ，19。简单地说，一个高功率的固态连续波激光器是用泵模式锁定钛蓝宝石激光器产生的波长范围从750〜830纳米的飞秒脉冲。激光束聚焦高NA显微镜物镜到样品上的衍射极限的地方。激励只发生在不久的光束，由于双光子激发的概率很低的重点地区。一对正交的计算机控制的扫描镜是用来转化样品在两个不同方向的整个协议（以下简称为X和 Y方向）的平面内的光束的焦点。从样品的照明体素背传播的荧光光谱成分分散到所排放的路径前灯高处坠落到一个EM - CCD阵列的像素事件透射光栅。因此，任何荧光分子/分子束的焦点区域内的全部光谱剖面是沿一维CCD阵列（y方向）获得。使用两个扫描镜运动，激光聚焦的位置可以沿着一条线垂直 y方向扫描范围内的样品。在这个单一的线扫描，荧光分子的光谱范围的RES通过保持打开的CCD相机的快门沿整条生产线的扫描iding收集在一个单一的激光束在样品扫描。积累在细胞内的不同的Y位置的这种性质的多行扫描，给出了大量居住在样品中的荧光络合物的光谱范围。从线扫描得到的图像重建给多个XY荧光强度的空间地图的样品在不同波长的18，19。为了准确地重建，并计算出实际的波长对应的 XY荧光强度的空间地图，必须进行校正，逐行扫描协议使用一个良好的特点的荧光光谱样本。
- 双光子显微镜的光谱解决累积在成像单元的低聚物复合物的光谱信息，通过扫描整个样品的利益激发光束的焦点，在一些地点。
- 一对正交扫描镜是用来翻译在两个不同的方向在样品的激光束的焦点。扫描镜的运动由电脑控制，并与CCD相机的荧光强度数据的提取同步。
- 从线扫描，相应的特定波长的光的荧光强度的空间地图可以重建。为了准确地重建XY荧光强度的空间地图，这些地图的相应计算出实际的波长，必须进行校正，逐行扫描协议，使用荧光解决方案。
- 要开始校准过程中，中心的激发光谱在800 nm波长，这是2X捐助标签的最大激发波长，绿色荧光蛋白 2 。中心的激发光谱，翻译在位于激光腔修改的群速度色散的棱镜。棱镜安装在一台计算机控制的线性机动阶段。
- 相机使用的计算机程序接口，发送一个命令到CCD芯片，以降低CCD芯片的温度，以达到其最低温度，以减少暗噪声。
- 吸取10微升到载玻片荧光解决方案。盖玻片覆盖，从而使样品的薄层均匀地分散在地区之间的盖玻片，在显微镜幻灯片。
- 浸油盖玻片表面上放置一个小降
- 现在， 系 XYZ翻译阶段的显微镜幻灯片和翻译的幻灯片/光轴方向的阶段，通过手动调节的线性驱动器，控制在光轴方向的阶段运动。转换的幻灯片/阶段，显微镜，直到接触到目标浸油的下降。
- 控制相机使用的计算机程序，切换到视频模式的数据采集，所以引人注目的CCD阵列所发出的光是在计算机屏幕上实时显示。慢慢地，调整千分尺控制在光轴方向的翻译阶段，把激光束的焦斑样品。
- 当荧光样品的重点是，排放量将出现一个CCD阵列上的尖锐线。下载从CCD阵列的计算机使用的计算机程序，控制摄像机的像素强度的读数。开放下载强度值矩阵图像J，并通过荧光地区绘图行的像素强度测量的CCD阵列的立场功能。使用图像J命令创建一个情节，说明荧光样品的发射光谱，分析→剧情简介。
- 调整增量参数控制在 y方向上的激光聚焦的运动，样本结果在一个像素的运动，以及在CCD上的光谱维度的荧光光谱的峰值内相邻的y位置的镜子，阵列。监测样本中有两个不同的y位置的荧光光谱强度值图像下载，开放力度图像与图像J，并找到为每个使用Image J光标的荧光光谱的峰值像素位置。
- 离开快门的CCD开放，扫描整个样品在 x方向上的激光聚焦。沿扫描线从每个体素发出的光线落在CCD阵列事件。
- 此行扫描得到的CCD阵列中存储的数据，然后清除像素的CCD阵列。
- 本节的第11步中确定的数额在 y方向上的激光聚焦的移动位置。
- 在 x方向的激光束在样品扫描，再次离开打开快门的CCD AR射线和存储数据。
- 物理领域重复，直到这条线扫描过程，一个生物细胞的尺寸更大的50％以上已被激光灯照亮。
- 一个特定的行扫描图像的行数和波长之间的关系应该用于重建图像获得多个XY不同波长的荧光强度的空间地图。为了获得一个特定的波长（λj）的XY荧光排放的形象，找到对应此波长从第一行扫描得到的图像的行数。相邻的行的下一行扫描图像对应的特定波长的荧光发射图像的下一行。堆栈中的所有图像的行对应的这个波长，以获得在该波长 XY荧光强度样品的空间地图。重复此过程中获得的所有其他波长。
- 要计算每个XY荧光强度的空间地图相关的波长，确定背景纠正每一个形象指数（J）的功能重建图像的归一化荧光强度。在光谱维像素的摄像头的位置和发射光子的波长之间的关系近似线性， 因此重建XY荧光强度的空间地图的图像和相应的波长之间的关系也是线性的计算如下：
m 的值是代表： 
在上面的形式主义，符号λj表示第 j重建图像的波长。从荧光样品的发射光谱中提取的λmax和λ 的值半，对应波长的荧光样品的荧光强度是最大的一个最大和一半，分别。图像指数j 最大 和 J ½重建图像具有最大的荧光强度最大的一半，分别对应于。
m 的值是代表： 
4。在生物样品的利益收集数据
- 为了您的样品收集数据，先删除从孵化板与转化的酵母菌菌落。应至少有三种类型转化细胞的全宽半高（FWHM）：
- 标记的荧光探针两种类型的细胞表达的蛋白质利益
- 细胞只表达荧光探针与捐助标签的蛋白质，
- 只有与受体的荧光探针标记的蛋白质的表达。
- 离心管加入100μL100 mM的氯化钾。使用微量尖，刮3-5酵母菌菌落与供体和受体的荧光探针标记蛋白表达的细胞板，并与这些细胞接种100 mM的氯化钾。
- 取出10μL的细胞悬液，并免除上一个新的显微镜幻灯片，盖上盖玻片液滴，放置在盖玻片表面的油滴。
- 在块到达显微镜物镜的激光灯，激光束的路径，手动关闭快门。
- 法尔胜XYZ翻译阶段的显微镜幻灯片，并将其转化幻灯片/光轴方向的阶段显微镜，直到接触到目标浸油的下降。
- 样本的宽视场图像会严重模糊，这是因为排放路径的透射光栅的存在。因此一个带通滤波器放置在光透射光栅的路径前的一个小的FWHM。打开的宽视场光照明，摄像头的视频模式的数据收集。慢慢地转化在光轴方向的翻译阶段，同时观看图像在相机屏幕上的细胞，待细胞聚焦
- 翻译中的x或y方向的激光束的焦点位置，以使单个细胞的阶段。
- 关闭的宽视场照明光源。删除带通滤波器，从排放路径。
- 解除封锁的时间很短（<1秒）的激光束，同时观看CCD阵列接收到的信号。如果激光束后的细胞事件在时间上的CCD阵列检测荧光信号，然后执行了这个细胞的荧光数据采集扫描。至关重要的是要使用相同的扫描参数，特别是线和Y增量，在CA确定早期展示的振动过程。
- 为表达捐助国标签和受体标记的蛋白质的细胞大量重复的单元格位置及荧光数据采集过程。
- 标签与这两种受体的蛋白质表达的细胞积累的荧光图像后，两个细胞只表达与捐助表达与受体的荧光探针标记只蛋白质荧光探针和细胞标记蛋白重复整个过程。
- 使用在第3节中描述的过程，重建所有的扫描，获得光谱解决XY荧光强度为每个数据集的空间地图。
5。图像分析
XY荧光强度的空间地图，从单一的萤光生物细胞扫描结果，每个像素包含居住在特定的像素对应的激发体素的分子复杂的全光谱剖面。如果感兴趣的蛋白质相互作用与另一个，这个光谱配置文件将包含一个混合的供体和受体的荧光探针的信号。为了确定利益的蛋白质之间的相互作用的性质，从这些蛋白质复合物在细胞的大量的光谱范围必须进行采样和明显的FRET效率（五 APP），激发态的比例定义捐助荧光探针成为转移到受体荧光探针通过FRET的每个像素，必须计算。
- 确定背景校正的荧光强度表达的蛋白质与捐助荧光探针标记的细胞在第4节所述的重建图像和正常化的最大值。由于这些重建图像的每一个都对应一个单独的波长（λj）的这种规范化的荧光强度值的集合，对应捐助探测器测得的发射光谱，I D（ λj）条。
- 重复步骤1细胞表达蛋白与受体荧光标记标记获得的受体探针测量的发射光谱，I A（λj）条。由于受体探针等，这是很少直接使用激光光源兴奋的选择，从受体只有样品产生的信号将会很低，并可能固有细胞的自体荧光信号的幅度相同的顺序。因此，以这种方式计算的测量受体荧光光谱，可能需要予以纠正，以消除在出发前的自体荧光的贡献。
- 使用在步骤1和第2步中获得的正常化频谱，频谱分解的细胞表达与捐助者与我的关系（λJ）= K DA受体荧光探针标记的蛋白质荧光探针和标记蛋白的荧光发射光谱中的每个像素I D（λJ）+ K 公元一A（λj）的地方我（λj）的代表测定荧光光谱每一个特定的像素。 的 K DA和 K 的AD值是成正比的捐助者中存在的受体和受体中存在的捐助者， 分别为5的荧光发射。
- 计算明显的FRET的效率，地图在细胞内的蛋白质的相互作用，在每个像素使用的公式，
。在这里， 问D和Q是，的供体荧光探针和受体的荧光探针的量子产率分别为W D和W一个正常化的供体和受体的发射光谱的积分分别为19，20。 - 最后，创建一个特定电子邮件应用程序的价值发生多少次是针对特定的价值， 电子应用绘制每个像素，使用电子商务应用程序的计算值的直方图。
。在这里， 问D和Q是，的供体荧光探针和受体的荧光探针的量子产率分别为W D和W一个正常化的供体和受体的发射光谱的积分分别为19，20。 6。直方图分析
为了从 E 应用直方图中提取定量信息，每个直方图理论上是符合高斯函数的总和，按下列公式计算： 
，
其中 A i是振幅，σ 我的标准偏差，和最有可能发送0I FRET 我第i个高斯函数的效率。不同的低聚物的大小S和配置会导致不同的电话号码，电子0I和不同的相关性，其中，17（ N）。例如，对于一个菱形形四聚体，五座山峰进行了预测，表1中列出的表达式给出。
表1。彼此之间的五个高斯峰的中心值和成对的关系FRET效率预测为菱形形四聚体。 
这意味着只有一个 E 0I值需要调整的数据拟合的过程中-一个对应的 E P -而其他四个 E P值计算。
- 假设一个低聚物的模型，并确定用于装修的E应用直方图 1高斯数。适合直方图，通过调整E P，一个我和σ 我 。注意直方图相对处置固定的模式。最小化的契合卡方或其他一些善良的配合功能。
- 假设另一个可能的低聚物模型和重复步数1。
- 选择最适合使用的参数数量的数据模型。这可能需要使用统计检验（如每卡方自由度数）。
代表性的成果
如图1所示，由此产生的k DA，K AD， 和E的应用空间地图光 谱解决双光子显微镜表达不育因子α（Ste2p）21，22在酵母细胞中进行的测量计算。
图1。酵母细胞表达的无菌2α-因子受体捐助（K DA）和受体（K AD）信号的二维地图，从应用到所拍摄的图像的每个像素点的位置，使用的频谱解决两个光子的光谱反卷积程序显微镜下的酵母细胞表达无菌2α-因子受体（Ste2p）。荧光强度分配假色，根据自己的价值观和规模作为插图所示。一个明显的FRET效率的二维图，计算使用 K DA 和K广告图片。
直方图的阴谋是准备用从发送应用程序图如图1所示的单元格中提取的值。图为图2拟合直方图情节相应的测量发送应用程序的值在图1的单元格（圆圈） 。红色实线代表到最适合的测量数据，使用个人高斯函数（绿色实线）的总和。
图2。 发送应用程序的酵母细胞表达α-因子受体不育2值的直方图的阴谋 。对应测量值的电子商务应用程序（圆圈）在图1中描绘的细胞直方图的情节所示。总结个人高斯函数（固体绿线），以模拟（红色实线）的测量值。高斯函数的参数是：E 01 = 16.7; 1 = 118.9;σ1 = 3.2，E 02 = 25.1; 2 = 100.0;σ2 = 4.6; E 03 = 32.6; 3 = 202.6;σ3 = 4.6; 发送04 = 40.1; 4 = 92.6;σ4 = 3.7，E 05 = 50.1; 5 = 16.0;σ5 = 7.9。
高斯之间的关系，意味着需要适合在图2中的直方图提出的数据表1中给出。高斯函数之间的关系的数量和对应的数量和E为菱形形四聚体低聚物复合应用程序的预期值之间的相互关系。因此，这是明显的双光子光谱解决测量Ste2p低聚物复杂假设形成一个菱形形四聚体在体内 19。
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Discussion
在此演示中，我们说明了如何确定的规模和在体内的蛋白质，低聚物复杂的结构信息。虽然所给出的数据是从一个特定的膜受体在酵母细胞中表达（即Ste2p），方法是包罗万象，它可应用于任何类型的蛋白质在任何类型的细胞，只规定表示，这些蛋白质与相应的荧光标记物标记。对本协议的未来修改将涉及加强文书，以达到更高的扫描速度，企图监视时间依赖性蛋白低聚物的规模和结构的变化。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由威斯康星大学密尔沃基分校的研究增长倡议“，威斯康星州的生物医学和卫生技术学院，和布拉德利基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
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