Summary
Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.
Abstract
Die Untersuchung von Protein-Interaktionen in lebenden Zellen ist ein wichtiger Bereich der Forschung, weil die Informationen sowohl Vorteile industrielle Anwendungen sowie Erhöhungen fundamentale biologische Wissen angesammelt. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einem Donor-Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand und einem nahe gelegenen Acceptormolekül wurde häufig für Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen eingesetzt. Die Proteine von Interesse sind mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Sonden markiert und ausgedrückt in biologischen Zellen. Die fluoreszierenden Sonden werden dann angeregt, in der Regel mit Hilfe von Laserlicht und die spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzemission, die aus der fluoreszierenden Sonden gesammelt und analysiert. Informationen über den Grad der Protein-Wechselwirkungen in der spektralen Emission Daten eingebettet. In der Regel muss die Zelle mehrmals gescannt werden, um genügend spektralen Informationen sammeln, um genau zu quantifizieren das Ausmaß der Protein-Interaktionen für jede Region von Interesse innerhalb der Zelle. Allerdings kann die molekulare Zusammensetzung dieser Regionen im Laufe des Erwerbs-Prozess zu ändern, wodurch die räumliche Bestimmung der quantitativen Werte der scheinbaren FRET Effizienzen auf durchschnittlich mehr als ganze Zellen. Durch eine spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskop, sind wir in der Lage, einen vollständigen Satz von spektral aufgelöste Bilder nach nur einem kompletten Scan Anregung der Probe von Interesse zu erhalten. Von diesem Pixel-Ebene spektralen Daten, FRET eine Karte von Effizienzen in der Zelle berechnet wird. Durch Anlegen einer einfachen Theorie von FRET in oligomeren Komplexen, die experimentell erhaltenen Verteilung der Effizienz der gesamten Zelle FRET, zeigt eine einzige spektral aufgelösten Scan stöchiometrischen und strukturelle Informationen über das Oligomer-Komplex unter-Studie. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biologischen Zellen (die Hefe Saccharomyces cerevisiae) zum Ausdruck Membranrezeptoren (steriles 2 α-Faktor-Rezeptoren) mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Sonden markiert. Darüber hinaus zeigen wir kritische Faktoren bei der Erhebung Fluoreszenz Daten unter Verwendung der spektral aufgelösten Zwei-Photonen-Mikroskopie-Systems beteiligt. Die Verwendung dieses Protokolls kann verlängert werden, um jede Art von Protein, das in einer lebenden Zelle mit einem fluoreszierenden Marker angebracht, um es zum Ausdruck gebracht werden kann, zu studieren.
Protocol
1. Plasmid-Design
Die Proteine von Interesse sind, zu einem von zwei verschiedenen fluoreszierenden Markierungen verschmolzen, wie im Folgenden beschrieben. Die fluoreszierenden Markierungen geben nicht nur Auskunft über die Lage der Proteine innerhalb der Zelle, sondern auch quantitative Informationen über die Homo-Oligomerisierung des Proteins 1. Die Technik des Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 2-4 wird verwendet, um die Information über die Protein-Interaktionen 5-10 akkumulieren. FRET nutzt das Prinzip, dass eine Übertragung von Energie kann aus einem optisch angeregten Moleküls (in der Regel als Spender, D bezeichnet) zu einem angeregten Molekül über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen 11 (in der Regel als Akzeptor A genannt), auftreten, wenn die beiden Moleküle kommen in unmittelbarer Nähe zueinander. Bei der Gestaltung der Plasmide der Fusionsproteine, zwei wichtige Funktionen im Hinterkopf getragen werden sollten, wie folgt.
- Auswählen eines kompatiblen Paar von fluoreszierenden Tags ist von größter Bedeutung in FRET-Untersuchungen. Idealerweise muss die fluoreszierende Markierung Kombination zwei Kriterien erfüllen: eine nennenswerte Überschneidungen in Wellenlängen zwischen dem Emissionsspektrum des Donors Tag und dem Anregungsspektrum des Akzeptors Tag, und ein großer Abstand zwischen der zentralen Wellenlänge des Laserpulses Spektrum und das Anregungsspektrum des Akzeptors (dh große Stokes-Shift). Zwei Varianten des grün fluoreszierenden Proteins 12, 13 sind besonders gut geeignet, diese Kriterien zu erfüllen: die GFP 2 als Donor 14 und dem gelb fluoreszierendes Protein (YFP) 12 oder eine Variante davon als Venus 15 als Akzeptor. Cerulean 16 könnte auch als Spender verwendet werden, wenn auch mit etwas bescheideneren Ergebnissen.
- In quantitative Bildgebung FRET ist es am besten, wenn nur ein Spender in einem molekularen Komplex in einer Zeit erregt wird (im Durchschnitt), so dass keine Konkurrenz zwischen den Gebern erfolgt für die Übertragung von Energie, um den gleichen Akzeptor in Komplexen, die mehr als einen Donor und Akzeptor enthalten . Dies führt zu Vereinfachungen in der Theorie und Datenanalyse Prozess 17. Aus diesem Grund ist der Pegel in der Regel gering. Um dies zu kompensieren, sollte die Expression der Proteine von Interesse relativ hoch sein. Hohe Expressionsraten werden mithilfe eines high-copy-Plasmid, das Protein-Gen in die Zelle tragen erreicht.
2. Hefe-Transformation
Es ist vorteilhaft, den Anteil der Zellpopulation die das Protein exprimieren Konstrukte von Interesse zu maximieren. Zu diesem Zweck verwandeln wir einen auxotrophen Stamm der Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae), unfähig, Tryptophan oder Uracil zu produzieren, mit zwei verschiedenen Plasmiden, eine mit dem Selektionsmarker Tryptophan und einen der Marker Uracil. Die Plasmide enthalten auch die Gene, die Anweisungen für die Zelle zu tragen, um das Protein von Interesse mit einem der beiden fluoreszierenden Sonden markiert auszudrücken. Die transformierten Zellen werden auf festem Medium-Platten, die auch mangelnde Tryptophan und Uracil gewachsen. Mindestens drei Arten von Zellen transformiert werden soll: Zellen, die Proteine von Interesse mit beiden Arten von fluoreszierenden Sonden, Zellen, die nur Proteine mit dem Spender Fluoreszenzsonden und Zellen, die nur Proteine mit dem Akzeptor fluoreszierenden Sonden markiert markiert markiert.
- Bereiten festen Medium Platten (1,7 g / L des Hefestickstoffbase w / o Aminosäuren, 1,6 g / L Hefe synthetischen Dropout-Medium w / o Uracil und Tryptophan, 2% [w / v] Glucose, 2% [w / v] Agar), die als Nährboden für die transformierten Zellen mindestens einen Tag vor der Transformation von Zellen verwendet werden. Die festen Medium Platten kann verwendet werden für bis zu zwei Monate nach der Zubereitung, wenn sie frei von jeglichen Verunreinigungen bleiben.
- Für jedes Plasmid-Paar umgewandelt werden, fügen Sie 10 ml YPD (10 g / L Bacto Hefeextrakt, 20 g / L Bacto Pepton und 2% [w / v] Glukose) in einen Erlenmeyerkolben. Incoluate der YPD mit einer Kolonie der auxotrophen Hefestamm Zellen umgewandelt werden.
- Setzen Sie den Erlenmeyerkolben mit der Hefekultur in einem Laborschüttler, die eine orbitale Verwirbelung an den Proben bietet, und inkubieren bei 30 ° C über Nacht am nächsten Morgen starten Sie die Überwachung des Wachstums der Zellkultur durch regelmäßiges Entfernen von einem kleinen Volumen die Kultur und testet seine optische Dichte (OD). Das Wachstum der Zellkultur sollte in Mitte logarithmischen Phase, dh einer OD von 0,5-1,0, die zum Zeitpunkt der Umwandlung.
- Deposit 5 ul der beiden Arten von Plasmiden in eine sterile Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Plasmid-Paar umgewandelt werden.
- Für jedes Paar Plasmid transformiert werden, fügen Sie 5 ul Lachssperma-DNA (5 mg / ml) in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen. Tauchen Sie die untere Hälfte der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Lachssperma-DNA in kochendem Wasser für 5 Minuten. Um die Kappe der Mikrozentrifugenröhrchen aus popping op verhindernen, nur tauchen die untere Hälfte der Mikrozentrifugenröhrchen in das Wasser. Nach dem Entfernen aus dem kochenden Wasser, legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Lachssperma-DNA in Eis für mindestens zwei Minuten.
- Add 5 ul Lachssperma-DNA jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit Plasmiden.
- Messen Sie die OD der wachsenden Hefekultur, um zu bestätigen, dass es Mitte der logarithmischen Phase (dh OD Lesen zwischen 0,5 und 1,0) erreicht.
- Centrifuge der Hefesuspension bei 1000xg für zwei Minuten.
- Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Hefepellet in sterilisierte VE-Wasser mit einem Vortex-Mischer.
- Die Suspension wieder auf 1000xg für zwei Minuten.
- Überstand verwerfen und das Pellet in einer Lösung von 0,1 M LiOAc in TE (1,02 g LiAc, 10 ml 1 M Tris bei pH 7,4 und 10 ml 0,1 M EDTA bei pH 8,0). Das Volumen von 0,1 M LiOAc in TE sollte gleich 1 / 100 th der ursprünglichen Hefekultur in YPD Volumen.
- Verteilen Sie 100 ul der Zellen zu jedem der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Plasmiden. Flick jedes Röhrchen vorsichtig, um die Zellen mit den Plasmiden mischen.
- Add 400 ul 44% [w / v] Polyethylenglykol (PEG 4000) Lösung für jedes der Reaktionsgefäße.
- Vorsichtig mischen die PEG 4000 mit den Zellen und Plasmide. Um zu vermeiden, brechen die Zellen, nicht mit einem Vortex-Mischer an diesem Punkt. Um vorsichtig mischen, halten Sie die Mikrozentrifuge Kappe und der Unterseite der Mikrozentrifugenröhrchen zwischen Zeigefinger und Daumen, langsam das Röhrchen, und dann langsam zu bringen das Rohr wieder in die aufrechte Position. Drehen Sie das Rohr 90 ° um seine Zylinderachse und langsam wieder umzukehren. Wiederholen Sie diesen Vorgang einige Male, so dass die Zellen auf der gesamten Oberfläche der Wände des Mikrozentrifugenröhrchen gleiten.
- Setzen Sie die Reaktionsgefäße in einem 30 °-Brutschrank für 45 Minuten.
- Nach 45 Minuten Inkubation, entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und wiederholen Sie den sanften Mischvorgang in 14 beschrieben.
- Setzen Sie die Reaktionsgefäße in einem 42 ° Wasserbad inkubieren für 15 Minuten. Noch einmal, nur tauchen die untere Hälfte der Mikrozentrifugenröhrchen in das Wasser.
- Nach dem 42 ° Inkubation 1 mL sterilisiert entionisiertem Wasser auf die Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einem Tabletop-Mikrozentrifuge für 5 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand aus den Rohren mit einem micropipetter.
- 100 l sterilisiertem destilliertem Wasser auf jedes der Reaktionsgefäße und mischen Sie die sterilisiert VE-Wasser mit den Zellen mit Hilfe der Inversion.
- Fügen Sie den Inhalt eines einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Nährmedium Platte, die für den jeweiligen Plasmiden hinzugefügt, dass Mikrozentrifugenröhrchen wählt. Fügen Sie 4-6 sterilisiert Glasperlen (1 mm Durchmesser). Schütteln Sie die Platte mit den Tropfen transformierten Hefezellen und Glasperlen in Ordnung, dass die Zellen über die Oberfläche des Agar Nährmedium verteilt sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Satz von transformierten Zellen.
- Legen Sie die Platten in einem 30 °-Inkubator für 3 bis 5 Tagen. Nach 3-5 Tagen werden mehrere Hefekolonien von 1-3 mm Durchmesser sichtbar auf der Oberfläche des Wachstumsmedium. Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen bereit, in die spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskop abgebildet werden.
3. Kalibrieren des spektral aufgelösten Zwei-Photonen-Mikroskop
Die spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskop in diesen Studien verwendet wurde im Detail an anderer Stelle 18, beschrieben 19. Kurz gesagt, ist ein High-Power-Solid-State-Dauerstrichlaser verwendet, um einen modengekoppelten Ti Pumpe: Saphir-Laser, die Femtosekunden-Pulsen von Wellenlängen im Bereich von ~ 750 bis 830 nm erzeugt. Der Laserstrahl wird durch eine hohe NA Mikroskop-Objektiv zu einem beugungsbegrenzten Fleck auf der Probe fokussiert. Anregung tritt nur in der Nähe Fokusbereich des Strahls aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit, dass zwei-Photonen-Anregung. Ein Paar von orthogonalen computergesteuerten Scanspiegel werden verwendet, um den Fokus des Strahls in der Ebene der Probe in zwei verschiedene Richtungen (bezeichnet als x-und y-Richtung über-Protokoll) zu übersetzen. Die Back-Verbreitung Fluoreszenzemission von einem beleuchteten Voxel der Probe wird in spektralen Komponenten durch ein Transmissionsgitter in den Pfad der Emission platziert, bevor das Licht einfällt auf die Pixel eines EM-CCD-Array verteilt. So ist die volle spektrale Profil von fluoreszierenden Moleküls / Moleküle im Fokus des Strahls entlang einer Dimension (y-Richtung) der CCD-Array erhalten. Mit der Bewegung von einer der beiden Scan-Spiegel kann die Position des Laserfokus in der Probe entlang einer Linie senkrecht zur y-Richtung gescannt werden. Indem die Verschlusszeit der CCD-Kamera öffnen während dieser einzigen Zeilenkamera, die spektrale Profile der fluoreszierenden Moleküle resIding auf der ganzen Linie der Überprüfung werden in einem einzigen Schwung der Laserstrahl über die Probe entnommen. Thesaurierende mehrere Linien-Scans dieser Art in unterschiedlichen y Stellen innerhalb der Zelle gibt die spektrale Profile von einer großen Anzahl von fluoreszierenden Komplexe mit Wohnsitz innerhalb der Probe. Die Bilder aus der Linien-Scans erhalten rekonstruiert werden, um mehrere xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten der Probe bei verschiedenen Wellenlängen 18, 19 geben. Um genau zu rekonstruieren und die Berechnung der tatsächlichen Wellenlänge entsprechend der xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten muss der Zeilenkamera-Protokoll kalibriert unter Verwendung einer Probe mit einem gut charakterisierten Fluoreszenzemissionsspektrum werden.
- Die spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskop sammelt spektralen Informationen über die Oligomer-Komplexe in der abgebildeten Zelle durch das Scannen der Fokus der Anregungsstrahl über die Probe von Interesse in einer Reihe von Standorten.
- Ein Paar von orthogonalen Scanspiegel wird verwendet, um den Fokus des Laserstrahls über die Probe in zwei verschiedene Richtungen übersetzen. Die Bewegung der Scanspiegel ist Computer gesteuert und synchronisiert mit der Gewinnung von Fluoreszenz-Intensität von Daten aus der CCD-Kamera.
- Von der Linien-Scans, kann Fluoreszenzintensität räumliche Karten entsprechend einer bestimmten Wellenlänge des Lichts, rekonstruiert werden. Um genau zu rekonstruieren xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten und berechnen die tatsächliche Wellenlänge entspricht jeder dieser Karten muss der Zeilenkamera-Protokoll kalibriert Fluorescein-Lösung sein.
- Zu Beginn der Kalibrierung, in der Mitte das Anregungsspektrum bei einer Wellenlänge von 800 nm, die von 2X die maximale Anregungswellenlänge des Spenders tag, GFP 2 ist. Zur Zentrierung der Anregungsspektrum, übersetzen das Prisma in der Laser-Resonator befindet, um die Gruppe digkeitsdispersion ändern. Das Prisma ist auf einem Computer gesteuert linear Motortisch montiert.
- Mit dem Computer-Programm die Kamera ist über eine Schnittstelle an, schicken Sie einen Befehl an den CCD-Chip, um die Temperatur des CCD-Chips auf den tiefsten erreichbaren Temperatur zu senken, um dunkle Rauschen zu verringern.
- Je 10 ul der Fluorescein-Lösung auf einen Objektträger. Abdeckung mit einem Deckglas, so dass eine dünne Schicht der Probe wird gleichmäßig in der Region zwischen dem Deckglas und dem Objektträger verteilt.
- Legen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die Oberfläche des Deckglases
- Befestigen Sie nun den Objektträger um die xyz-Übersetzung Bühne und übersetzen die Folie / Bühne in Richtung der optischen Achse durch manuelles Anpassen der Linearantrieb, die die Bühne Bewegungen des Körpers steuert in Richtung der optischen Achse. Übersetzen Sie die Dia / Bühne, bis die Mikroskop-Objektiv kommt in Kontakt mit den Tropfen Immersionsöl.
- Mit dem Computerprogramm, das die Kamera steuert, wechseln Sie zu einem Video-Modus der Datenerfassung so das emittierte Licht auf die CCD-Array auf dem Bildschirm in Echtzeit angezeigt wird. Langsam, passen Sie die Mikrometer Steuerung der Übersetzung der Bühne in Richtung der optischen Achse, um die Probe in den Brennfleck des Laserstrahls zu bringen.
- Wenn das Fluorescein Probe im Fokus ist, wird die Emission als eine scharfe Linie auf dem CCD-Array erscheinen. Laden Sie das Auslesen der Pixel-Intensitäten aus dem CCD-Array mit dem Computer über das Computer-Programm die Steuerung der Kamera. Messen Sie die Pixel-Intensität als Funktion der Position auf dem CCD-Array durch Öffnen der heruntergeladenen Matrix Intensitätswerte in Image J und Zeichnen einer Linie durch die fluoreszierenden Region. Verwenden Sie das Image J Befehl Analyze → Plot Profil auf eine Darstellung, die das Emissionsspektrum des Fluorescein Probe zu schaffen.
- Passen Sie die inkrementelle Parameter der Spiegel, der die Bewegung des Laserfokus in y-Richtung, so dass benachbarte y-Positionen innerhalb der Probe führen die Bewegung der Spitze der Fluoreszenzspektren von genau einem Pixel entlang der spektralen Dimension auf dem CCD-Steuerelemente Array. Überwachen Sie diesen, indem Sie die Fluorescein-Spektren Intensität Wert auf die Grafik für zwei verschiedene y-Positionen in der Probe, dem Öffnen der Intensität von Bildern mit Image J, und die Suche nach dem Gipfel Pixelposition für jeden der Fluoreszenzspektren mit dem Image J Cursor.
- Verlassen Sie den Verschluss der CCD öffnen, scannen des Laserfokus auf der Probe in x-Richtung. Das Licht von jedem Voxel entlang der Linie des Scan emittiert sollte Vorfall auf dem CCD-Array fallen.
- Bewahren Sie die Daten aus dem CCD-Array für dieses Line-Scan erhalten und deaktivieren Sie dann die Pixel des CCD-Arrays.
- Bewegen Sie die Position des Laserfokus in y-Richtung um den Betrag in Schritt 11 in diesem Abschnitt bestimmt.
- Scan der Laserstrahl in x-Richtung über die Probe wieder verlassen Öffnen Sie den Verschluss des CCD-array und Speicherung der Daten.
- Wiederholen Sie diese Zeile Scanvorgang, bis eine physische Fläche ~ 50% größer als die Abmessungen eines einzelnen biologischen Zellen durch Laserlicht beleuchtet.
- Die Beziehung zwischen Zeilennummer eines bestimmten Zeilenkameras Bild und Wellenlänge verwendet, um die Bilder zu rekonstruieren, um mehrere xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten bei verschiedenen Wellenlängen zu erhalten. Um die xy Fluoreszenzemission Bild für eine bestimmte Wellenlänge (λ j), finden Sie die Nummer der Zeile auf das Bild von der ersten Zeile scannen, die zu dieser Wellenlänge entspricht erhalten. Dann werden die benachbarten Reihe der nachfolgenden Zeilen-Bild entspricht der nächsten Zeile der Fluoreszenzemission Bild für die jeweilige Wellenlänge. Stack all das Bild Zeilen, die auf dieser Wellenlänge entsprechen den xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten der Probe bei dieser Wellenlänge zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen erhältlichen Wellenlängen.
- Zur Berechnung der Wellenlänge mit jedem xy Fluoreszenzintensität räumliche Karte verbunden sind, bestimmen den Hintergrund korrigierte normierte Fluoreszenzintensität jedes rekonstruierte Bild als eine Funktion der Bild-Index (j). Die Beziehung zwischen Kamera-Pixel-Position in der spektralen Dimension und die Wellenlänge der emittierten Photonen ist annähernd linear, daher die Beziehung zwischen dem rekonstruierten xy Fluoreszenzintensität räumliche Karte Bilder und entsprechende Wellenlänge ist auch linear und wie folgt berechnet:
wobei der Wert von m wird vertreten durch: 
In dem obigen Formalismus, stellt das Symbol λ j der Wellenlänge der j-ten rekonstruierte Bild. Die Werte von λ max und λ ½ aus dem Emissionsspektrum des Fluorescein Probe extrahiert und entsprechen den Wellenlängen, bei denen die Fluoreszenz-Intensität der fluoreszierenden Probe wird ein Maximum und die Hälfte der maximalen bzw.. Das Bild Indizes j max und j ½ der rekonstruierten Bilder besitzen die maximale Fluoreszenzintensität und die Hälfte der maximalen bzw. entsprechen.
wobei der Wert von m wird vertreten durch: 
4. Das Sammeln von Daten über biologische Proben von Interesse
- Um Daten über Ihre Proben, zunächst aus dem Inkubator der Platten zu entfernen mit transformierten Hefe-Kolonien. Es sollten mindestens drei Arten von transformierten Zellen in voller Breite Halbwertsbreite (FWHM):
- Zellen, die Proteine von Interesse mit beiden Arten von fluoreszierenden Sonden markiert
- Zellen, die nur Proteine mit dem Spender fluoreszierenden Sonden markiert und
- Zellen, die nur Proteine mit dem Akzeptor fluoreszierenden Sonden markiert.
- Geben Sie 100 ul 100 mM KCl, um ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mit einer Mikropipette Spitze, kratzen 3-5 Hefekolonien off der Platte von Zellen, die Proteine sowohl mit Donor-und Akzeptor fluoreszierenden Sonden markiert und impfen die 100 mM KCl mit diesen Zellen.
- Entfernen 10 l der Zellsuspension und verzichten sie auf eine frische Objektträger, decken Sie die Tropfen mit einem Deckglas, und legen Sie einen Tropfen Öl auf die Oberfläche des Deckglases.
- Manuelles Schließen des Verschlusses in den Weg des Laserstrahls auf das Laserlicht vom Erreichen der Mikroskop-Objektiv blockieren.
- Befestigen Sie die Objektträger um die xyz-Übersetzung Bühne und übersetzen die Folie / Bühne in Richtung der optischen Achse, bis das Mikroskop-Objektiv kommt in Kontakt mit den Tropfen Immersionsöl.
- Das weite Feld Bild der Probe wird stark durch die Anwesenheit des Transmissionsgitter in der Emission Weg verwischt werden. Deshalb Ort ein Bandpassfilter mit einer kleinen FWHM in den Strahlengang vor dem Transmissionsgitter. Schalten Sie das weite Feld-Beleuchtung, und gehen Sie auf die Kamera-Video-Modus der Datenerhebung. Langsam übersetzen die Übersetzung der Bühne in Richtung der optischen Achse, während Sie das Bild der Zellen auf dem Kameradisplay bis die Zellen in den Fokus gebracht werden
- Übersetzen der Bühne in der x-oder y-Richtung, um eine einzelne Zelle, um die Position des Laserstrahls Fokus zu bringen.
- Schalten Sie das weite Feld Lichtquelle. Entfernen Sie die Bandpass-Filter aus dem Emissions-Pfad.
- Unblock der Laserstrahl für eine kurze Zeit (<1 Sekunde), während gleichzeitig das Signal, auf das CCD-Array erhalten. Wenn ein Fluoreszenz-Signal wird auf dem CCD-Array während der Zeit der Laserstrahl trifft auf die Zelle erkannt wird, dann führen Sie eine vollständige Fluoreszenz Datenerfassung Scannen von dieser Zelle. Es ist wichtig, um die gleiche Scan-Parameter, insbesondere Anzahl der Zeilen und y erhöhen, wie in der ca bestimmungsgemäßen GebrauchLibration Verfahren zuvor demonstriert.
- Wiederholen Sie die Zelle Lage und Fluoreszenz-Datenerfassung Prozess für eine große Zahl von Zellen, Proteinen an beiden Spender-Tags und Akzeptors tags.
- Nach dem Einsammeln Fluoreszenzaufnahmen von Zellen, die Proteine mit den beiden Rezeptoren getaggt, wiederholen Sie den gesamten Prozess sowohl für Zellen, die nur Proteine mit dem Spender Fluoreszenzsonden und Zellen, die nur Proteine mit dem Akzeptor fluoreszierenden Sonden markiert markiert.
- Mit dem Verfahren in Abschnitt 3 beschrieben, zu rekonstruieren alle Scans zu spektral aufgelöste xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten für jeden Satz von Daten zu erhalten.
5. Bildanalyse
Jedes Pixel des xy Fluoreszenzintensität räumliche Karten, die aus einem einzigen Scan eines fluoreszierenden biologischen Zelle, enthält die volle spektrale Profil der molekularen Komplex mit Wohnsitz in der Erregung Voxel entspricht, dass bestimmte Pixel. Wenn die Proteine von Interesse miteinander interagieren, wird diese spektrale Profil enthalten eine Mischung von Signalen sowohl von der Donor-und Akzeptor fluoreszierende Sonden. Um die Natur der Interaktionen zwischen den Proteinen von Interesse zu bestimmen, müssen die spektralen Profile aus einer großen Anzahl dieser Protein-Komplexe in eine Zelle entnommen und die scheinbare FRET-Effizienz (E app), definiert als der Anteil der angeregten Zustände des Spenders fluoreszierende Sonde, die auf den Akzeptor fluoreszierende Sonde über FRET werden übertragen, der jedes Pixel berechnet werden muss.
- Bestimmen Sie die Hintergrund-korrigierten Fluoreszenz-Intensität für jede der rekonstruierten Bilder in Abschnitt 4 für Zellen, die Proteine mit nur dem Spender fluoreszierenden Sonden markiert beschrieben und zu normalisieren, um den maximalen Wert. Da jedes dieser rekonstruierten Bilder entspricht einem separaten Wellenlängen (λ j) dieser Sammlung von normierten Fluoreszenzintensität Werte entspricht dem gemessenen Emissionsspektrum des Donors Sonden, D i (λ j).
- Wiederholen Sie Schritt 1 für Zellen, die Proteine nur mit dem Akzeptor fluoreszierende Tags versehen, um die gemessene Emissionsspektrum des Akzeptor-Sonden zu erhalten, i A (λ j). Da der Akzeptor-Sonde ist so gewählt, dass sie nur selten direkt angeregten über die Laserquelle ist, wird das Signal ausgehend von Akzeptor nur Proben niedrig sein und eventuell auf der gleichen Größenordnung wie die Zellen innewohnenden Autofluoreszenz-Signal. Daher kann die gemessene Akzeptor Fluoreszenz-Spektrum auf diese Weise berechneten müssen korrigiert werden, um den Beitrag der Autofluoreszenz, bevor Sie fortfahren zu entfernen.
- Mit der normierten Spektrum in Schritt 1 und Schritt 2 erhalten, spektral zerlegen jedes Pixel des Fluoreszenzemissionsspektrum von Zellen, die beide Proteine mit fluoreszierenden Sonden Spender und Proteine mit Akzeptor fluoreszierende Sonden mit der Beziehung I (λ j) = k DA getaggt getaggt i D (λ j) + k AD i A (λ j), wo ich (λ j) stellt jedes einzelne Pixel gemessen Fluoreszenzspektrum. Die Werte von k und k DA AD sind proportional zur Fluoreszenz-Emission von Spendern in Gegenwart von Akzeptoren und von Akzeptoren in Anwesenheit der Spender, bzw. 5.
- Berechnen Sie die scheinbare FRET-Effizienz, die die Interaktion von Proteinen in der Zelle an jedem Pixel mit Hilfe der Formel Karten,
. Hier Q D und Q A sind die Quantenausbeuten der Spender fluoreszierende Sonde und Akzeptor fluoreszierende Sonde bzw. w und D und w A sind die Integrale der normierten Donor und Akzeptor Emissionsspektrum, bzw. 19, 20. - Schließlich erstellen Sie ein Histogramm mit den berechneten Werten von E-App für jedes Pixel, wobei die Anzahl, wie oft eine bestimmte E app-Wert tritt gegen den jeweiligen Wert des E app aufgetragen ist.
. Hier Q D und Q A sind die Quantenausbeuten der Spender fluoreszierende Sonde und Akzeptor fluoreszierende Sonde bzw. w und D und w A sind die Integrale der normierten Donor und Akzeptor Emissionsspektrum, bzw. 19, 20. 6. Histogramm-Analyse
Um quantitative Informationen aus dem E app Histogramme zu extrahieren, ist jeder Histogramm theoretisch mit einer Summe von Gauß-Funktionen passen, nach der folgenden Formel berechnet: 
,
wobei A i die Amplitude ist, σ i die Standardabweichung und E 0i die wahrscheinlichste FRET Effizienz des i-ten Gauß-Funktion. Verschiedene Oligomer Größes und Konfigurationen auf verschiedene Zahlen (n) der E 0i und unterschiedliche Korrelationen zwischen ihnen 1, 17 führen. Zum Beispiel für einen rautenförmigen Tetramer sind fünf Peaks vorausgesagt, gegeben durch die Ausdrücke in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1. Beziehung zwischen jedem der fünf Gauß-Gipfel Mitte-Werte und die paarweise FRET-Effizienz für eine Rautenform Tetramer vorhergesagt. 
Das bedeutet, dass nur eine E 0i Wert muss in den Prozess der Daten passend eingestellt werden - die eine entsprechende E p - während die anderen vier aus dem Wert von E p berechnet werden.
- Angenommen, ein Oligomer Modell und identifizieren die Anzahl der Mittelwerte in der Montage der E app Histogramme 1 verwendet werden. Fit im Histogramm durch eine Anpassung E p, A i und σ i. Beachten Sie, dass die relative Anordnung der Histogramme von dem Modell fixiert ist. Minimieren Sie das Chi-Quadrat der fit oder eine andere Güte-of-fit funktionsfähig.
- Nehmen wir ein anderes Modell wahrscheinlich Oligomer und wiederholen Sie Schritt Nummer 1.
- Wählen Sie das Modell, das am besten passen die Daten für die Anzahl der Parameter verwendet. Das kann verlangen, mit einem statistischen Test (wie der Chi-Quadrat nach der Anzahl der Freiheitsgrade).
Repräsentative Ergebnisse
Illustrated in Abbildung 1 sind die resultierenden k DA, k AD und E app räumliche Karten aus spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-Messungen an einer Hefezelle Ausdruck der steriles 2 α-Faktor (Ste2p) 21, 22 durchgeführt berechnet.
Abbildung 1. Hefezelle Ausdruck der steriles 2 α-Faktor-Rezeptor. Zweidimensionale Karten von Donor (k DA) und Akzeptor (k AD) Signale wurden von der spektralen Entfaltung Verfahren angewandt, um für jeden einzelnen Pixel der Bilder aufgenommen mit der spektral aufgelösten Zwei-Photonen erhalten Mikroskop von einer Hefezelle Ausdruck der steriles 2 α-Faktor-Rezeptor (Ste2p). Fluoreszenzintensitäten sind falsche Farben nach ihren Werten und die Waage ist als Einschub gezeigt zugeordnet. Eine zweidimensionale Karte der scheinbaren FRET-Effizienzen wurden mit dem k DA und k AD Bilder.
Ein Histogramm Plot wurde unter Verwendung der Werte aus der E app Karte der Zelle in Abbildung 1 dargestellt extrahiert. Abgebildet in Abbildung 2 ist das Histogramm ausgestattet Grundstück entsprechend der gemessenen E app-Werte (Kreise) der Zelle in Abbildung 1 dargestellt. Die rote durchgezogene Linie stellt die beste Anpassung an die gemessenen Daten mit der Summe der einzelnen Gauß-Funktionen (grüne durchgezogene Linien).
Abbildung 2. Histogramm von E app-Werte für eine Hefezelle Ausdruck der steriles 2 α-Faktor-Rezeptors. Das Histogramm Plot, der die Messwerte (Kreise) der E-App für die Zelle in Abbildung 1 entspricht, wird angezeigt. Individuelle Gauß-Funktionen (durchgezogene grüne Linien) werden summiert, um zu simulieren (durchgezogene rote Linie) die gemessenen Werte. Gauß-Funktion Parameter sind: E 01 = 16,7; A 1 = 118.9; σ 1 = 3,2; E 02 = 25,1; A 2 = 100,0; σ 2 = 4,6; E 03 = 32,6; A 3 = 202,6; σ 3 = 4,6; E 04 = 40,1; A 4 = 92,6; σ 4 = 3,7; E 05 = 50,1; A 5 = 16,0; σ 5 = 7,9.
Die Beziehungen zwischen Gauß-Mittel benötigt, um die Daten im Histogramm in Abbildung 2 dargestellt sind in Tabelle 1 angegeben fit. Die Anzahl und die Korrelation zwischen Gauß-Funktionen entspricht die Anzahl und die Korrelationen zwischen den zu erwartenden E app-Werte für Rautenform Tetramer Oligomer-Komplexen. Daher ist es aus der spektral aufgelösten Zwei-Photonen-Messungen gezeigt, dass die Ste2p Oligomer komplexer die Form eines Rhombus förmigen Tetramer in vivo 19 übernimmt.
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Discussion
In diesem Vortrag dargestellt wir, wie man die Größe und strukturelle Informationen über ein Protein-Oligomer-Komplex in vivo zu bestimmen. Während die vorgestellten Daten aus einer bestimmten Membran-Rezeptor (dh Ste2p) in Hefe-Zellen exprimiert erhalten wurde, ist die Methode, allumfassend, dass sie auf jede Art von Protein in jeder Art von Zelle, die einzige Bedingung zum Ausdruck angewendet werden kann, dass die Proteine sind mit den entsprechenden fluoreszierenden Markern gekennzeichnet. Zukünftige Änderungen an diesem Protokoll wird beinhalten die Verbesserung der Instrumente, höhere Scan-Geschwindigkeiten in einem Versuch, Zeit-abhängige Protein-Oligomer Größe und Struktur Veränderungen überwachen zu erreichen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der UW-Milwaukee Forschung Wachstumsinitiative, die Wisconsin-Institut für Biomedizinische und Health Technologies, und der Bradley-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
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