Summary
आनुवंशिक संघों अक्सर एक कार्यात्मक स्तर पर अस्पष्टीकृत रहते हैं. इस विधि के लिए जीन अभिव्यक्ति पर लिखित SNPs के लिए विषमयुग्मजी कोशिकाओं का विश्लेषण करके phenotype - जुड़े आनुवंशिक मार्करों के प्रभाव का आकलन करना है. प्रौद्योगिकी MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सटीक माप एलील विशिष्ट प्राइमर विस्तार उत्पादों यों की अनुमति देता है.
Protocol
1) सेल संस्कृति
- सेल प्रकार व्यक्त हित के जीन का चयन करें.
- डीएनए जोखिम वेरिएंट और ब्याज की जीन (चित्रा 1) के भीतर लिखित कोडन बहुरूपता के लिए दोनों विषमयुग्मजी सेल लाइनों का चयन करें.
- संस्कृति आपूर्तिकर्ता विनिर्देशों और डीएनए और आरएनए की निकासी के लिए क्रमश: 2 x 10 सेमी पेट्री डिश तैयार अनुसार चयनित सेल लाइनों है.
- जब कोशिकाओं तक पहुँचने के 80% संगम फसल कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया शुरू करने के लिए और या तो नीचे वर्णित की प्रक्रिया के बाद या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर अलग डीएनए और आरएनए.
2) डीएनए निष्कर्षण
- पकवान से मीडिया निकालें, Pbs के साथ धोने और lysis समाधान (0.6% एसडीएस, 100 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris, 20 मिमी EDTA और 50 μg / एमएल RNase एक) का पकवान 500 μL जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए थाली धीरे रॉक.
- एक microcentrifuge ट्यूब और सेते में 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेल lysate परिमार्जन.
- 100 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता proteinase कश्मीर जोड़ें और 37 ° रातोंरात सी पर सेते हैं.
- Phenol के क्लोरोफॉर्म 8 पीएच, दोहराने के एक समान मात्रा के साथ डीएनए निकालें, तो क्लोरोफॉर्म / isoamyl शराब की एक समान मात्रा के साथ निकाल सकते हैं.
- 1 / 10 वें मात्रा 3 एम NaCl और 100% इथेनॉल 2.5 संस्करणों के साथ डीएनए वेग .
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दो और फिर 4 बजे 30 मिनट के लिए 13,000 rpm पर स्पिन डिग्री सेल्सियस
- 70% इथेनॉल के साथ डीएनए धो, हवा शुष्क और ते के 200 μL में resuspend अनुमति देते हैं.
- 65 में सेते डिग्री सेल्सियस 10 मिनट और फिर कमरे के तापमान पर 2 दिनों के लिए छुट्टी के लिए.
- 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक -20 डिग्री सेल्सियस
3) शाही सेना निकालना
- पकवान से मीडिया निकालें, Pbs के साथ धोने, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए TRIzol और सेते के 1 एमएल जोड़ने.
- परिमार्जन कोशिकाओं, एक microcentrifuge ट्यूब में एक बार कुछ हस्तांतरण, पिपेट और 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- 4 में 10,000 rpm पर 10 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस
- एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और क्लोरोफॉर्म की 200 μL जोड़ने.
- हिलाएँ और 4 पर 10,000 rpm पर 10 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस
- एक ताजा ट्यूब में जलीय चरण स्थानांतरण और 70% इथेनॉल एक बराबर मात्रा में जोड़ें.
- 1 या 2 (मात्रा के आधार पर) RNeasy और अधिकतम गति से 30 सेकंड के लिए स्तंभ स्पिन करने के लिए समाधान लोड.
- यहाँ से RNeasy किट (Qiagen) के अनुदेश का पालन करें.
4) न्यूक्लिक एसिड नमूना तैयार
- डीएनए और आरएनए एकाग्रता एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग कर यों.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार यादृच्छिक decamers और सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (Invitrogen) का उपयोग शाही सेना के 500-1000 एनजी से सीडीएनए तैयार करें.
5) पीसीआर और प्राइमर विस्तार परख
- प्रत्येक डीएनए मार्कर के लिए पीसीआर प्राइमरों, जीनोमिक डीएनए प्रवर्धन के लिए एक जोड़ी और सीडीएनए प्रवर्धन के लिए अन्य जोड़ी (चित्र 2) के दो जोड़े के डिजाइन. आगे प्लेस और जीनोमिक संक्रमण से बचने के लिए सीडीएनए प्रवर्धन के लिए विभिन्न exons में प्राइमर रिवर्स. डिजाइन के लिए 100-500 बीपी लंबाई की सीमा में एक पीसीआर उत्पाद प्राप्त प्राइमर.
- एक 10 μL पीसीआर प्रतिक्रिया सहित 0.5 यू Immolase (Bioline) Taq 0.8 मिमी dNTPs, 2 मिमी 2 MgCl, 0.2 एम प्रत्येक प्राइमर और या तो सीडीएनए या डीएनए के 20 एनजी तैयार. चार स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं में प्रत्येक नमूना बढ़ाना.
- प्रत्येक प्राइमर जोड़ी प्रवर्धन के रैखिक चरण में चक्र संख्या रखने के लिए अनुकूलित की शर्तों के तहत पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएँ.
- Exonuclease साथ पीसीआर उत्पाद incubating पीसीआर प्राइमर और dNTPs अतिरिक्त निकालें और चिंराट 37 alkaline फॉस्फेट (एसएपी) ° सी 20 मिनट के लिए.
- प्रत्येक पीसीआर उत्पाद 384 अच्छी तरह से थाली पर दो बार स्पॉट है, इसलिए है कि 8 माप प्रत्येक नमूना के लिए उपलब्ध हो जाएगा.
- परख डिजाइन सॉफ्टवेयर (Sequenom) के साथ विस्तार प्राइमर दोनों जीनोमिक और सीडीएनए पीसीआर उत्पादों के लिए इतना है कि एक ही प्राइमर इस्तेमाल किया जा सकता है डिज़ाइन. 14-18 बीपी 3ddNTPs के संयोजन (चित्र 2) सहित और विस्तार मिश्रण की रेंज में प्राइमर लंबाई निर्दिष्ट करें.
- कैर्री बाहर प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया और MALDI-TOF/MS विश्लेषण निर्माता अनुदेश के अनुसार MassARRAY प्रणाली (Sequenom) का उपयोग कर.
- एक ठेठ प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया 94 पर 2 मिनट के लिए शुरू ° कदम सी, 5 एस के लिए 5, 52 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 एस और 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 ° सी के 40 चक्रों द्वारा पीछा शामिल
- प्राइमर विस्तार उत्पादों SpectroCLEAN राल के साथ साफ कर रहे हैं और SpectroPOINT nanolitre निकालने की मशीन द्वारा माइक्रोएरे (चिप) पर स्थानांतरित हैं.
- विस्तारित oligonucleotides एक SpectroREADER मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग MALDI-TOF द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं.
6) सांख्यिकी विश्लेषण
- MassARRAY टाइपकर्ता सॉफ्टवेयर के साथ प्रयोग के सामान्य गुणवत्ता के लिए MALDI-TOF/MS परिणाम की जाँच करें.
- Allelotyping रिपोर्ट जो पीक क्षेत्र डेटा शामिल निकालें.
- के लिए प्रत्येक व्यक्ति के स्पेक्ट्रम की गणनाएलील 1 और 2 एलील (चोटी क्षेत्र अनुपात) के शिखर क्षेत्र के बीच का अनुपात.
- प्रत्येक सीडीएनए का नमूना के लिए एक चोटी क्षेत्र अनुपात मतलब है और मानक विचलन निकाले जाते हैं, Excel में इसी समारोह 8 माप भर का उपयोग करते हुए.
- जीनोमिक डीएनए के लिए 8 measurments भर में एक ही मतलब चोटी क्षेत्र अनुपात निकाले जाते हैं.
- जीनोमिक मतलब अनुपात उम्मीद 1:1 के अनुपात में विचलन का आकलन द्वारा सीडीएनए मतलब अनुपात फूट डालो.
7) प्रायोगिक नियंत्रण
- प्रयोगात्मक कलाकृतियों शासन करने के लिए, प्रयोग कम से कम तीन बार दोहराएँ.
- संभव है, जब भी अतिरिक्त डीएनए मार्कर के लिए डिजाइन assays.
- कई पीसीआर प्राइमर जोड़े और विस्तार दोनों आगे और रिवर्स किस्में करने के लिए annealing प्राइमरों डिजाइन.
- जब भी नकारात्मक नियंत्रण सेल लाइनों है कि डीएनए मार्कर के लिए विषमयुग्मजी हैं लेकिन डीएनए जोखिम phenotype के साथ जुड़े वेरिएंट नहीं ले के रूप में संभव परीक्षण (1 छवि और छवि 3.)
8) प्रतिनिधि परिणाम
एलील विशिष्ट अभिव्यक्ति विश्लेषण का एक उदाहरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री निशान के उदाहरण के साथ चित्रा 3 में दिखाया गया है. आंकड़ा 4 एलील विशिष्ट प्राइमर विस्तार 4 अलग टेम्पलेट्स पर बाहर किए गए उत्पादों के विश्लेषण से परिणाम से पता चलता है है. शीर्ष रेखांकन दो अलग अलग सेल लाइनों, जो एक लिखित कोडन बहुरूपता के लिए दोनों विषमयुग्मजी के जीनोमिक डीएनए के विश्लेषण से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं. हालांकि, केवल सेल लाइन जोखिम डीएनए संस्करण (चित्रा 1) के लिए विषमयुग्मजी है. कम रेखांकन एक ही सेल लाइनों से उत्पन्न सीडीएनए के विश्लेषण से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रयोगात्मक artifact के एक परिणाम के रूप में पहली शिखर हमेशा जीनोमिक विश्लेषण में भी दूसरी चोटी की तुलना में अधिक है. इसलिए, जीनोमिक विश्लेषण से परिणाम सीडीएनए डेटा मानक के अनुसार किया जाता है. सामान्यीकरण के बाद, एलील अनुपात 1 से सेल लाइन में काफी अलग है (जहां दूसरा शिखर अन्य स्पेक्ट्रा की तुलना में कम दिखाई देता है), जबकि यह बहुत सेल लाइन में 1 के लिए करीब बी डेटा है कि सेल लाइन का सुझाव एक वहन दूसरा चोटी है, जो विश्लेषण के तहत जीन की अभिव्यक्ति को कम कर देता है के द्वारा मापा एलील के साथ चरण में डीएनए संस्करण. सेल लाइन बी के एक बहुत ही सुविधाजनक नकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है.
चित्रा 1. सेल लाइन चयन रणनीति सेल लाइनों ए और बी एक लिखित कोडन मार्कर (त्रिकोण) के लिए विषमयुग्मजी लेकिन केवल सेल लाइन एक जोखिम डीएनए संस्करण (चक्र) के लिए विषमयुग्मजी है. जोखिम संस्करण के नीले एलील (या तो एक प्रत्यक्ष प्रभाव के साथ या वास्तविक कार्यात्मक संस्करण के साथ घनिष्ठ संबंध में क्योंकि) प्रतिलेखन के एक निचले स्तर के साथ जुड़ा हुआ है.
चित्रा 2. ऐल्लि विशिष्ट प्राइमर विस्तार परख. यह आंकड़ा प्रयोगात्मक दोनों सीडीएनए (बाएं) और जीनोमिक डीएनए (दाएं) टेम्पलेट्स के लिए किया प्रक्रिया का काम प्रवाह दिखा . पीसीआर प्राइमरों (धूसर आयत) को एक विषमयुग्मजी कोडन बहुरूपता (त्रिकोण) बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. से बचने के जीनोमिक संदूषण पीसीआर प्राइमरों दृश्यों अलग (हल्के नीले सलाखों) exons जब प्रवर्धन सीडीएनए टेम्पलेट पर किया जाता है में रखा पानी रखना. पीसीआर उत्पाद तो एक विस्तार प्राइमर के साथ बाहर ले एक किताब विस्तार प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया, एक बहुरूपता के लिए अगले आधार annealing, और तीन dideoxynucleotide का उचित मिश्रण (ddNTPs) terminators (वर्ग) और एक deoxynucleotide (चक्र) का विस्तार करने के लिए क्रमश: एक या दो के आधार प्राइमर. परिणामस्वरूप प्राइमर विस्तार उत्पादों अलग जनता जो जुदाई और MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री से मात्रा का ठहराव की अनुमति है. डीएनए मार्कर के नीले एलील इसी उत्पाद की मात्रा अपेक्षाकृत लाल एलील के लिए कम है.
चित्रा 3. एक एलील विशिष्ट अभिव्यक्ति परख परिणाम आंकड़ा विश्लेषण से मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणाम जीनोमिक डीएनए पर बाहर किए गए और सेल लाइन के सीडीएनए दिखाने के एक और सेल लाइन बी (चित्रा 1) .
Discussion
इस विधि प्रतिलेख स्तर में vivo एलील विशेष अंतर का आकलन करके रोग से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति पर डीएनए वेरिएंट के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है. इस प्रोटोकॉल में रिश्तेदार प्रतिलेख बहुतायत MALDI-TOF लेकिन अन्य एलील विशिष्ट ऐसे 6,7 TaqMan के रूप में मात्रा का ठहराव, की अनुमति प्रौद्योगिकियों के द्वारा मापा जाता है, इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण के प्रमुख सीमा कोडन लिखित मार्करों की उपलब्धता है. सिद्धांत पर आधारित तरीके यहाँ वर्णित है, लेकिन बहुरूपताओं के विभिन्न वर्गों के लाभ लेने, वर्णित किया गया है. haploChip परख एलील विशेष transcriptional शुरू करने या एक जीन जो chromatin immunoprecipitated द्वितीय 8 पोलीमरेज़ आरएनए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ अलग सामग्री में मौजूद होगा के अंत साइट के 1 केबी के भीतर स्थित मार्कर का उपयोग कर अभिव्यक्ति के उपाय. वैकल्पिक रूप से, intronic SNPs जब टेम्पलेट heteronuclear 9 शाही सेना इस्तेमाल किया जा सकता है .
विशिष्ट प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, haploChip परख के साथ संयोजन में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है डिस्लेक्सिया (या पढ़ने विकलांगता) के लिए एक उम्मीदवार जीन की पहचान. शुरू में एक आनुवंशिक संघ अध्ययन एक डीएनए डिस्लेक्सिया और जो तीन 10 जीनों फैले था के साथ जुड़े अनुक्रम की पहचान की . एलील विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति परख से पता चला है कि डिस्लेक्सिया जुड़े डीएनए वेरिएंट अभिव्यक्ति भिन्नता की उपस्थिति में केवल तीन जीनों के एक लिए मनाया था, लेकिन दो अन्य नहीं 11.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
के लिए अनुदान के माध्यम से इस काम के लिए वेलकम ट्रस्ट द्वारा वित्त पोषित किया गया था एपीएम [076566/Z/05/Z], JCK [074318] और ह्यूमन जेनेटिक्स के लिए एक कोर वेलकम ट्रस्ट सेंटर पुरस्कार [075491/Z/04].Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Phenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Exonuclease 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | |
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | |
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Equipment | |||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | ||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
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- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
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