हम कैल्शियम कैल्शियम विज्ञप्ति सक्रिय के पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग (CRAC) परिधीय रक्त mononuclear व्युत्पन्न सेल मानव टी lymphocytes में धाराओं के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
टी lymphocytes, 2 Ca की कमी intracellular Ca से 2 + + दुकान plasmalemmal Ca 2 के सक्रियण के लिए होता है + चैनलों, रिलीज सक्रिय कैल्शियम कैल्शियम चैनल (CRAC) कहा जाता है. CRAC चैनलों टी सेल प्रसार और जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. गंभीर संयुक्त इम्यूनो और autoimmune 1 रोगों, 2 टी कोशिकाओं में असामान्य CRAC चैनल समारोह जोड़ा गया है. मानव टी कोशिकाओं में CRAC चैनल समारोह अध्ययन नया आणविक सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित तंत्र को उजागर करने और संबंधित मानव रोगों के कारणों को सुलझाना सकता है. झिल्ली धाराओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग कार्यात्मक चैनल गुण और उनके विनियमन के सबसे सटीक आकलन प्रदान करते हैं. CRAC Jurkat टी कोशिकाओं, एक मानव लेकिमिया टी सेल लाइन में चैनल धाराओं के electrophysiological मूल्यांकन पहले 20 से अधिक वर्षों के 3 पहले प्रदर्शन किया गया था, तथापि, सामान्य मानव टी कोशिकाओं में CRAC वर्तमान माप एक चुनौती भरा काम रहता है. सामान्य टी कोशिकाओं में CRAC चैनल धाराओं रिकॉर्डिंग करने में कठिनाइयों तथ्य यह है कि रक्त व्युत्पन्न टी lymphocytes Jurkat टी कोशिकाओं की तुलना में आकार में बहुत छोटे और, इसलिए, अंतर्जात पूरे सेल CRAC धाराओं आयाम में बहुत कम हैं कर रहे हैं से बढ़ रहे हैं. यहाँ, हम एक कदम दर कदम प्रक्रिया है कि हम नियमित Ca 2 रिकॉर्ड का उपयोग + या ना + मानव टी स्वस्थ स्वयंसेवकों के परिधीय रक्त से अलग कक्षों के आराम में CRAC चैनलों के माध्यम से धाराओं. देना विधि यहाँ वर्णित Jurkat टी कोशिकाओं में CRAC धाराओं रिकॉर्डिंग और मानव टी कोशिकाओं 4-8 सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं से अपनाया गया था.
मानव टी कोशिकाओं के आराम में CRAC धाराओं के electrophysiological जांच एक चुनौतीपूर्ण कार्य है क्योंकि इन कोशिकाओं में अंतर्जात CRAC वर्तमान आयाम छोटे छोटे सेल आकार (आराम मानव टी सेल व्यास 5-8 सुक्ष्ममापी की रेंज में है) के …
The authors have nothing to disclose.
हम सुविधाओं और आयन चैनल के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट वातावरण के साथ हमें प्रदान करने के लिए फिजियोलॉजी और झिल्ली जीवविज्ञान, विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया डेविस विभाग के लिए आभारी हैं.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
Windows Computer | Dell | |||
Pulse software | HEKA Instruments | |||
Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |