Summary
यहाँ हम तुरंत शुद्ध द्वारा intraperitoneal टीका के बाद और fluorescently संक्रमित मस्तिष्क तो उनके और इंजेक्शन साइट से तेज आंदोलन की निगरानी और इन घटनाओं mediating कोशिकाओं निस्र्पक सामग्री से एकत्रित prion छड़ लेबलिंग prion और प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा तेज तस्करी की निगरानी के लिए एक उपन्यास परख का वर्णन.
Protocol
1. शुद्ध और लेबल prion छड़
इस प्रोटोकॉल से पहले प्रकाशित 18 अनुकूलित है
- बर्फ के ठंडे homogenizing बफर के 900 एमएल में 100 prion संक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों के ग्राम (एचबी 1X पीबीएस 320 मिमी sucrose, 150 मिमी NaCl और 4mm EDTA युक्त) अधिकतम गति पर एक वाणिज्यिक ब्लेंडर में 1 मिनट, तो बर्फ पर 2 मिनट homogenize. तीन बार दोहराएँ.
- 3000 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए homogenate अपकेंद्रित्र निकालें और बर्फ पर सतह पर तैरनेवाला बचाने. 1L एचबी में गोली पुनः निलंबित और 1.1 और 1.2 चरणों को दोहराएँ.
- 100.000 XG, 0 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए पूल और supernatants अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 1X Tris के 100 एमएल में पुनः निलंबित गोली buffered खारा (10 Tris - एचसीएल मिमी 0.1 मिमी NaCl और 1 मिमी EDTA) 2% Triton एक्स 100 (TBST) युक्त. अनुमान ब्रैडफोर्ड या इसी तरह परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता और 5 मिलीग्राम / TBST में एमएल समायोजित. 30 मिनट के लिए बर्फ पर शांत रहो.
- 100.000 XG, 0 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 50 एमएल TBST तो 100 एमएल टीबीएस के साथ गोली धोने. 100 एमएल 1X पीबीएस 1% sarcosyl और protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त में गोली पुनः निलंबित और 37 में 120 मिनट के लिए हलचल डिग्री सेल्सियस
- 320 मिमी और 60 मिनट के लिए sucrose अपकेंद्रित्र के 900 एमएल पर 100.000 XG, 10 डिग्री सेल्सियस पर नमूना परत सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पुनः निलंबित 10 एमएल 2.3m NaCl में गोली, 5% sarcosyl.
- बर्फ पर 1 मिनट के अंतराल पर 70% की अधिकतम शक्ति पर नमूना 5 x 40 सेकंड Sonicate.
- विभाज्य 13,000 XG, 4oC पर पंद्रह मिनट के लिए और ट्यूबों Eppendorf के अपकेंद्रित्र में 1 नमूना की एमएल. छर्रों टीबीएस और दुकान के साथ दो बार धो -70 @ डिग्री सेल्सियस या 1.9 चरण में fluorochrome संयुग्म.
- संयुग्म prion DyLight 649 1 की शीशी का उपयोग छड़ शुद्ध का एक ट्यूब निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार fluorochrome.
- डायलिसिस या फिल्टर स्तंभों के माध्यम से centrifugation द्वारा विनिमय DyLight पीबीएस के लिए लेबलिंग बफर. -70 ° प्रकाश से दूर सी जब तक का उपयोग करने के लिए तैयार 20 μL aliquots में स्टोर.
2. Prion टीका और सेल रिकवरी
यह खंड intraperitoneal prion टीका और peritoneum, mediastinal और mesenteric लिम्फ नोड्स और तिल्ली से कोशिकाओं की वसूली शामिल हैं.
- फ्लोरोसेंट prion 1:50 पीबीएस में छड़ के तुरंत पहले उपयोग करने के लिए पतला. अंगूठे और तर्जनी के साथ पृष्ठीय गर्दन फर द्वारा कूड़ा माउस, माउस धीरे बारी करने के लिए आप चेहरे और कनिष्ठा उंगली के साथ पूंछ को नियंत्रित. माउस Supinate, सिर के ऊपर हिंद धड़ को ऊपर उठाने और उसे थोड़ा उल्टा पकड़े.
- एक 30g इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, फ्लोरोसेंट prion 1 सेमी midline और 1-2 सेमी sacroiliac संयुक्त करने के लिए पूर्वकाल के पार्श्व छड़ के 100 μL इंजेक्षन. सुई त्वचा के माध्यम से 1 सेमी 45 ° medially निर्देशित डालें. नियंत्रण के रूप में फ्लोरोसेंट मोती या पीबीएस अकेले 1:50 कमजोर पड़ने का उपयोग करें. विश्लेषण से पहले आवंटित समय के लिए चूहों को सेते हैं.
- अनुमोदित जानवरों की देखभाल के अनुसार चूहों euthanize और समिति प्रोटोकॉल का उपयोग करें. एक 12 एमएल सिरिंज और 25g सुई का उपयोग peritoneal गुहा में पीबीएस की 10 एमएल इंजेक्षन. धीरे लोथ longitudinally रॉक एक मिनट के लिए. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और रिजर्व में बर्फ पर एक ही सिरिंज और एक 16G सुई जबकि लोथ विच्छेदन जारी का उपयोग पेरिटोनियम से सेल निलंबन पुनर्प्राप्त.
- 70% इथेनॉल के साथ लोथ के उदर पक्ष को अच्छी तरह गीले. संदंश के साथ ribcage नीचे बस midline पर त्वचा को लिफ्ट और कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा चीरा में कटौती. वहाँ शुरू, दोनों दिशाओं में से सिर और पूंछ के लिए त्वचा के माध्यम से एक 3-5 सेमी लंबे चीरा बनाने के लिए, तो प्रत्येक के अंत से midline से दो चीरों laterally 2 सेमी. वापस पील और peritoneal और वक्ष cavities प्रकट करने के लिए त्वचा पिन. ध्यान पतली पारदर्शी पेरिटोनियम झिल्ली के माध्यम से कटौती और मध्यस्थानिका प्रकट छाती को प्रतिबिंबित.
- ढूँढें और 2-4 mediastinal लिम्फ नोड्स, थोड़ा पृष्ठीय और thymus laterally आसन्न, ट्रेकिआ के उदर पक्ष के पास medially brachiocephalic धमनी करने के लिए आसन्न हटा दें. ढूँढें और छह mesenteric लिम्फ नोड्स, नरम सफेद mesenteric ऊतकों में एम्बेडेड हटायें कि एंकर पीछे पेट की दीवार के लिए आंतों. ढूँढें और तिल्ली, एक लंबे, गहरे लाल सिर्फ midline के पार्श्व और पेट की बाईं तरफ आंतों के लिए पृष्ठीय स्थित अंग को हटा दें. रिजर्व लिम्फ नोड्स 1 बर्फ पर एमएल RPMI 1640 मध्यम में जब तक विच्छेदन पूरा हो गया है.
- सिझाना और एक 40 सुक्ष्ममापी RPMI के 3 एमएल में एक प्लास्टिक पेट्री 1 एमएल सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग पकवान में जाल छलनी के माध्यम से लिम्फ नोड्स प्रेस. RPMI के एक अतिरिक्त 2 एमएल के साथ झरनी कुल्ला और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब 5 एमएल सेल निलंबन हस्तांतरण. RPMI की एक अतिरिक्त 5 एमएल के साथ पेट्री डिश कुल्ला और एक ही ट्यूब को हस्तांतरण. 250 XG पर 5 मिनट अपकेंद्रित्र, 1 एमएल FACS बफर (1X पीबीएस, 1% गोजातीय सीरम albumin और 10 मिमी EDTA) में सतह पर तैरनेवाला, फिर निलंबित सेल गोली त्यागें और एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण.
निम्नलिखित अच्छी तरह से विशेषता प्रतिरक्षा कोशिका की सतह मार्करों के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग प्रतिरक्षा सेल सबसेट की पहचान के लिए एक ठेठ धुंधला प्रोटोकॉल है. सभी एंटीबॉडी FACS बफर में तुरंत उपयोग करने से पहले पतला थे.
- Eppendorf ट्यूबों में कोशिकाओं और विभाज्य 10 6 कोशिकाओं की गिनती . अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (2.7 देखें) और 1 एमएल FACS बफर के साथ धोने गोली 2X.
- कोशिकाओं 2 एनजी / एमएल चूहे CD16/32 विरोधी माउस अंतर्जात एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक के 100 μL में बर्फ पर 20 मिनट सेते हैं. गोली और FACS बफर के साथ धोने कोशिकाओं.
- एक घंटे के लिए प्रत्येक और बर्फ पर नमूना सेते 1ng / एमएल उपयुक्त फ्लोरोसेंट antibod एँ (y) के 100 μL जोड़ें. नियंत्रण कक्ष के FACS अकेले बफर के 100 μL जोड़ें. गोली और FACS बफर के साथ दो बार धोने कोशिकाओं.
- 1 एमएल ACK (150 राष्ट्रीय राजमार्ग 4 सीएल मिमी, 1 मिमी KHCO 3 और 0.1 मिमी EDTA) बफर 1 से लाल रक्त कोशिकाओं lyse मिनट के लिए बर्फ पर सेते में पुनः निलंबित कोशिकाओं. गोली और FACS बफर के साथ धोने कोशिकाओं. 1 एमएल FACS बफर में कोशिकाओं पुनः निलंबित.
- एक प्रवाह cytometer बहुरंगा पता लगाने और विश्लेषण करने में सक्षम आमतौर पर, 405, 488 और 633 एनएम उत्तेजना लेज़रों और पांच को दस प्रतिदीप्ति उत्सर्जन डिटेक्टरों के साथ कोशिकाओं से डेटा ले लीजिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
हम कच्चे तेल से शुद्ध prion छड़, prion संक्रमित मस्तिष्क homogenate (चित्रा 1) डिटर्जेंट और E2 एल्क मस्तिष्क homogenate (1 गलियों और 2) के solubilization ultracentrifugation बहुत prion (गलियों 1 और 3 की तुलना) छड़, जो भी था protease कश्मीर के लिए समृद्ध प्रतिरोधी (4 लेन). दिलचस्प है, पचाया नहीं शुद्ध prion छड़ glycoform strikingly पचा E2 मस्तिष्क homogenate के समान प्रोफ़ाइल प्रदर्शित prions के लिए नाटकीय संवर्धन का संकेत है. हूबहू का इलाज सामान्य मस्तिष्क homogenate कोई पीके प्रतिरोधी PRP सी (5 गलियों और 6) का उत्पादन किया.
फ्लो विशेष सेल आबादी के cytometric विश्लेषण प्रदर्शन प्रतिजन दो घंटे से कोशिकाओं peritoneum के लिए घर पेश करने और फ्लोरोसेंट माला और prion छड़, पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण से अधिक नाटकीय रूप से वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति (चित्रा 2) के द्वारा evidenced के रूप में बनाए रखने कि. पीबीएस के इलाज पृष्ठभूमि ऊपर प्रतिदीप्ति (Figs. 2A जी) प्रदर्शित नियंत्रण के peritoneum से काटा जबकि मनका (Figs. 2H - एन) से कोशिकाओं और prion (Figs. 2O यू) inoculated महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति प्रदर्शित चूहों, कोशिकाओं, विशेष रूप से monocytes पर (Figs. 2I और पी), वृक्ष के समान कोशिकाओं (Figs. 2K और आर) और मैक्रोफेज (Figs. 2L और एस), और कुछ neutrophils (चित्रा 2J और क्यू) और कम बी कोशिकाओं (चित्रा 2T ). मनका और prion असर monocytes, वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज भी टीका (Figs. 2AD और एके, वायुसेना और AM और एजी और ए.एन. क्रमशः), जबकि कुछ या कोई PRP CWD असर neutrophils के बाद दो घंटे mediastinal लिम्फ नोड्स में पाया गया , बी या टी कोशिकाओं वहाँ पाए गए (Figs. 2AE और अल, मुख्यालय और एजी और एअर इंडिया और एपी, क्रमशः). हम कोई तिल्ली या mesenteric लिम्फ नोड्स (नहीं दिखाया डेटा है) या मोती prion छड़ का पता चला. Toto में, इन आंकड़ों को दिखाना है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं यातायात अन्य कण एंटीजन को बहुत इसी तरह prions.
| अभिकर्मक | FLUOROCHROME | उत्तेजना लेजर (एनएम) | चोटी उत्सर्जन (एनएम) |
| Prion छड़ | 649 DyLight | 633 | 674 |
| 1 सुक्ष्ममापी मोती | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| एंटीबॉडी | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Phycoerythrin - Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | आर - Phycoerythrin | 488 | 575 |
| Phycoerythrin - Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | आर - Phycoerythrin | 488 | 575 |
| CD21 | 488 DyLight | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin - Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | आर - Phycoerythrin | 488 | 575 |
चित्रा 1. संक्रमित मस्तिष्क homogenate से prion छड़ के शोधन. हम एक हिरण CWD से संक्रमित (E2, 1and गलियों 2) से सामग्री से जो हम एकत्रित prion छड़ (3 गलियों और 4) शुद्ध शुरू के रूप में एक 10% कच्चे मस्तिष्क homogenate का इस्तेमाल किया. दोनों कच्चे और शुद्ध सामग्री protease कश्मीर उपचार (1 गलियों - 4) विशेषता प्रतिरोध दिखाया है, जबकि सामान्य मस्तिष्क homogenate (5 गलियों और 6) नहीं करता है. आण्विक वजन मार्करों केडी में दाग की बाईं करने के लिए दिखाए जाते हैं. बिहार, मस्तिष्क homogenate.
चित्रा 2. फ्लो प्रतिरक्षा कोशिकाओं पेरिटोनियम से mediastinal लिम्फ नोड्स के लिए तस्करी prions के दो घंटे के बाद cytometric विश्लेषण टीका. पीबीएस (पैनल एजी और वि एबी), फ्लोरोसेंट (हेमवती और एसी ऐ) माला या prion छड़ (कहां और aj-AP ) peritoneal lavage द्रव (एयू) या mediastinal लिम्फ (वि एपी) दो घंटे बाद नोड्स से काटा चूहों और कोशिकाओं के peritoneum में इंजेक्ट किया. पीबीएस (पैनल एक और वी), फ्लोरोसेंट मोती (पैनल एच और एसी) और prion छड़ (पैनल हे और ए जे) के साथ इलाज चूहों से पहले स्तंभ शो कोशिकाओं में रेखाचित्र. प्रतिदीप्त (लाल या हरे रंग की डॉट्स) कोशिकाओं और कुल कोशिकाओं (ग्रे डॉट्स) के सापेक्ष आकार (आगे स्कैटर), granularity (पक्ष स्कैटर) और कुल जीवित कोशिकाओं है कि प्रतिदीप्ति के अनुपात दिखाने प्लॉट किए जाते हैं. Granulocytes की विशेषता कोशिकाओं के महत्वपूर्ण संख्या फ्लोरोसेंट मोती और छड़ को बनाए रखा. कक्ष भी प्रतिरक्षा सेल की सतह मार्करों और LyG - Ly6C + monocytes के लिए gated (पैनल बी, मैं, पी, डब्ल्यू, ई. और एके), Ly6c - CD11c - CD11b + Ly6G neutrophils + (सी, जे, क्यू, एक्स, एई के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग थे और अल) Ly6G - Ly6C - CD11b + CD11c + वृक्ष के समान (डी, कश्मीर, आर, वाई, वायुसेना और AM) कोशिकाओं, Ly6G - Ly6C - CD11c - CD11b + मैक्रोफेज, (ई, एल, एस, जेड एजी, और ए.एन.), CD3 -B220 + CD21 + (एफ एम, टी, ए.ए., मुख्यालय और ए ओ) बी कोशिकाओं और CD21-B220-CD3 + टी कोशिकाओं (जी, एन, यू, अटल बिहारी, एअर इंडिया और एपी). Monocytes, वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज peritoneal गुहा (पैनल मैं और पी, कश्मीर और अनुसंधान और एल और एस, क्रमशः) में फ्लोरोसेंट माला और prion छड़ को बनाए रखा और उन्हें mediastinal लिम्फ नोड्स (पैनल ई. और एके, वायु सेना और एजी AM और के लिए ले जाया और एक, क्रमशः), समान और इन दो particulates के तेज तस्करी का प्रदर्शन. Neutrophils मोती (जे) और कम छड़ (क्यू) का एक महत्वपूर्ण राशि को बनाए रखा, लेकिन उन्हें लिम्फ नोड्स में वितरित (AE और अल) करने में विफल रहा है. बी कोशिकाओं को बनाए रखा पहुँचाया और कुछ छड़ (टी और ए ओ), लेकिन वस्तुतः कोई मोती (एम और मुख्यालय). टी कोशिकाओं तस्करी न तो मोती न ही छड़ (एन, यू, एअर इंडिया और एपी).
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Discussion
यहाँ हम vivo में है कि बहुत परिधीय prion संक्रमण में जल्दी घटनाओं की निगरानी की सुविधा में टैगिंग और ट्रैकिंग prions के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. इस प्रोटोकॉल बहुत पूर्व लेबलिंग अत्यधिक समृद्ध prion inoculum द्वारा 9 इन विट्रो में और vivo में 3,12 निगरानी prion तेज अतीत असंदिग्ध रूप से यह अंतर्जात PRP सी से अलग करने का प्रयास पर सुधार. क्योंकि संक्रामक prions और PRP सी एक ही प्राथमिक अमीनो एसिड अनुक्रम का हिस्सा है, पैदा prion विशिष्ट एंटीबॉडी समस्याग्रस्त किया गया है. हम PRP अशक्त पीके पचा और मेथनॉल है कि हम 649 - labelelled विरोधी PRP एंटीबॉडी (हमारे अप्रकाशित डेटा) Dylight का उपयोग पर नज़र रखी कच्चे मस्तिष्क homogenate उपजी के साथ चूहों अंतःक्षिप्त का उपयोग इसी तरह के प्रयोगों का प्रदर्शन किया है. इन प्रयोगों उत्पादन लगभग समान परिणाम के रूप में यहाँ दिखाया गया है, लेकिन PRP अशक्त चूहों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं prion 19 रोग के लिए अतिसंवेदनशील हैं और केवल प्रामाणिक prion जाना रिसेप्टर, PRP सी की कमी है. इस प्रोटोकॉल आम प्रयोगशाला माउस उपभेदों कि अंतर्जात PRP व्यक्त सी, संभावित समस्याओं PRP अशक्त चूहों का उपयोग obviating के उपयोग की अनुमति देता है.
यहाँ दिखाया गया डेटा कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर कब्जा और यातायात prions और फ्लोरोसेंट मोती इसी तरह का संकेत है, हालांकि बी कोशिकाओं पूर्व लेकिन नहीं उत्तरार्द्ध की तस्करी के रूप में पहचान की गई है. यह पिछले अध्ययनों implicating prion 6 तस्कर के रूप में बी कोशिकाओं की पुष्टि होती है. हालांकि, हमारे अत्यधिक समृद्ध prion तैयारी की संभावना अतिरिक्त लेबल प्रोटीन की मात्रा मिनट होते हैं, तो हम बाहर नहीं संभावना है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं यातायात इन प्रोटीन भी शासन कर सकते हैं. क्या प्रोटीन contaminating की बहुत छोटी मात्रा prion तस्करी को बदलने या mimics सच जैविक परिदृश्य को निर्धारित किया है.
प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तस्करी दो अलग particulates के सफल निगरानी आगे पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल परजीवी, बैक्टीरिया, वायरस और प्रोटीन जैसे कि और टैग नज़र रखी जा सकता है एंटीजन की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है.
जब इस प्रोटोकॉल में ultracentrifugation कदम प्रदर्शन, बड़े नमूना संस्करणों के छोटे लोगों के लिए सुविधाजनक centrifugation के लिए किया जा सकता है के रूप में लंबे समय aliquoted के रूप में अनुपात स्थिर रहेगा. उदाहरण के लिए, 900 एमएल sucrose के 100 से अधिक नमूने के एमएल layering के बजाय, एक अलग नलियों में परत 90 एमएल से अधिक 10 एमएल, तो अपकेंद्रित्र सकता है.
माउस inoculations के दौरान पीछे से ऊपर उठाने peritoneal अंगों पूर्व से चलता है, उन्हें आकस्मिक सुई चोट कम से कम. धीरे धीरे और ध्यान से सुई को सम्मिलित जब चूहों inoculating और इंजेक्शन और aspirating पेरिटोनियम से पीबीएस इस नाजुक झिल्ली rupturing से बचने.
जब चूहों विदारक, ध्यान रखना करने के लिए केवल प्रारंभिक चीरों में त्वचा हालांकि कटौती, पतली झिल्ली को कवर peritoneum और मध्यस्थानिका बरकरार छोड़ने के काटने रक्त वाहिकाओं और अंगों है कि लसीका नोड की पहचान और पुनर्प्राप्ति के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं से बचने के.
लिम्फ नोड्स के लिए शुरू की पहचान, अक्सर वसा ऊतकों की तरह लग रही करने के लिए मुश्किल हो सकता है. लिम्फ नोड्स लगभग गोल, बंद सफेद क्रीम रंग और वसा ऊतकों की तुलना में मजबूत दिखाई देते हैं. ये अभ्यास के साथ की पहचान बहुत आसान हो गया है. कम से कम दो चूहों से पूल लिम्फ नोड्स प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को ठीक करने के लिए.
एक साथ कई कोशिका की सतह मार्करों की पहचान करने के लिए, हम दृढ़ता से unlabeled एंटीबॉडी कि एक माध्यमिक पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट विरोधी निर्धारण एंटीबॉडी की आवश्यकता से अधिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं, के रूप में कई प्रजातियों और कई और अधिक अतिरिक्त नियंत्रण के नमूने से उत्पन्न एंटीबॉडी के उत्तरार्द्ध प्रयोगात्मक डिजाइन सावधान चयन की आवश्यकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम स्टीव McBryant और जेफ Hansen ultracentrifugation और पट्टी Kiser के साथ माउस से निपटने के साथ मदद के लिए मदद के लिए धन्यवाद. स्नायविक रोग और स्ट्रोक के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान, 5R01NS056379 02-अनुदान इस काम वित्त पोषित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
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