Summary
Aqui nós descrevemos um ensaio de romance para o monitoramento e captação de prion tráfico por células do sistema imunológico imediatamente após a inoculação intraperitoneal de purificação e fluorescente rotulagem varas prion agregados de material cerebral infectado acompanhamento da sua absorção e movimento a partir do local da injeção e caracterizar as células mediadoras desses eventos.
Abstract
Presença de uma forma anormal de uma proteína prion host-codificado (PrPC) que é resistente à protease, patológicas e infecciosas caracteriza doenças de príon, como a doença crônica Wasting (CWD) de cervídeos e scrapie em ovinos. A hipótese de Prion afirma que esta conformação anormal constitui a maior parte ou todo o príon infeccioso. O papel do sistema imunológico em eventos precoces na patogênese da prion periféricos tem sido convincentemente demonstrada por CWD e 1-3 scrapie. Transgênicos e farmacológicas estudos em ratos revelou um importante papel do sistema complemento na manutenção e replicando prions início após a infecção 4-6. In vitro e in vivo estudos também observaram retenção de prion pelas células dendríticas 10/07, apesar de seu papel no tráfico permanece claro 11-16. Macrófagos têm igualmente sido implicados na patogênese da prion cedo, mas esses estudos concentraram-se em eventos que ocorrem semanas após a infecção 3,11,17. Estes estudos anteriores também sofrem com o problema da diferenciação entre endógena PrP C e príons infecciosos. Aqui nós descrevemos uma abordagem imparcial semiquantitativo para avaliar a absorção de príon eo tráfico a partir do sítio de inoculação de células do sistema imunológico recrutados lá. Hastes prion agregados foram purificados a partir de homogenato de cérebro infectado por solubilização de detergente não agregados de proteínas e ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose. Eletroforese em gel de poliacrilamida, coomassie coloração azul e recuperação de mata-borrão ocidental confirmados de varas prion altamente enriquecido na fração peletizada. Hastes príon foram fluorocromo marcado por via intraperitoneal, em seguida, injetadas em ratos. Duas horas mais tarde células imunológicas de lavado peritoneal, baço e gânglios linfáticos do mediastino e mesentéricos foram ensaiadas para a retenção de prion haste e subpopulações de células identificadas por multicolor citometria de fluxo utilizando marcadores para monócitos, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos e células B e T. Este ensaio permite o monitoramento direto da primeira vez que células do sistema imunológico aquisição e prions tráfico in vivo dentro de horas após a infecção. Este ensaio também diferencia claramente infecciosas, prions agregadas de PrPC normalmente expressa em células do hospedeiro, que pode ser difícil e levar a problemas de interpretação de dados em sistemas de ensaio de outros. Este protocolo pode ser adaptado para outras rotas de inoculação (oral, intravenosa, subcutânea e intranervous, por exemplo) e antígenos (grânulos conjugados, patógenos bacterianos, virais e parasitárias e proteínas, o ovo) também.
Protocol
1. Purificação e Rotulagem Rods Prion
Este protocolo foi adaptado de um 18 previamente publicados
- Homogeneizar 100 gramas de prion infectados tecido cerebral em 900 mL de tampão de homogeneização gelada (HB, 1X PBS contendo sacarose 320 mM, 150 mM NaCl e 4 mM EDTA) 1 min na velocidade máxima em um liquidificador comercial, em seguida, 2 min no gelo. Repita três vezes.
- Centrífuga homogeneizado por 10 min a 3000 xg e 4 ° C. Retire e guarde o sobrenadante no gelo. Re-suspender sedimento em 1L HB e repita os passos 1.1 e 1.2.
- Sobrenadantes piscina e centrifugar por 60 min a 100.000 xg, 0 ° C. Elimine o sobrenadante.
- Re-suspender pellet em 100 ml de 1X Tris salina tamponada (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl e 1 mM EDTA) contendo 2% Triton X-100 (TBST). Concentração de proteína pela estimativa Bradford ou ensaios semelhantes e ajustar a 5 mg / mL em TBST. Frio no gelo por 30 min.
- Centrifugar por 30 min a 100.000 xg, 0 ° C. Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 50 TBST mL, em seguida, 100 mL TBS. Re-suspender pellet em 100 ml de 1X PBS contendo 1% sarcosyl e coquetel inibidor de protease e mexa por 120 min a 37 ° C.
- Camada de amostra em 900 mL de 320 mM de sacarose e centrifugar por 60 min a 100.000 xg, 10 ° C. Elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 10 mL 2,3 M NaCl, sarcosyl 5%.
- Sonicate amostra de 5 x 40 segundos na potência máxima de 70% em intervalos de 1 min no gelo.
- ML de amostra de uma alíquota em tubos eppendorf e centrifugar por 15 minutos a 13.000 xg, 4oC. Lave duas vezes com TBS pellets e armazenar @ -70 ° C ou conjugado fluorocromo no passo 1.9.
- Conjugado de um tubo de varas purificada prion usando 1 frasco de 649 DyLight fluorocromo de acordo com o protocolo do fabricante.
- Troca de buffer rotulagem DyLight para PBS por diálise ou centrifugação através de colunas de filtro. Loja em 20 mL alíquotas a -70 ° C ao abrigo da luz até que esteja pronto para uso.
2. Inoculação príon celular e Recuperação
Esta seção abrange a inoculação intraperitoneal prion e recuperação de células do peritônio, linfonodos mediastinais e mesentéricos e baço.
- Diluir varas prion fluorescentes 1:50 em PBS imediatamente antes da utilização. Rato Scruff pela pele do pescoço dorsal com o polegar eo dedo indicador, delicadamente por sua vez do mouse para enfrentá-lo e restringir cauda com pinky dedo. Supinate mouse, elevando o tronco traseiras acima da cabeça e segurando-o levemente de cabeça para baixo.
- Usando uma seringa de insulina 30G, injectar 100 mL de varas prion fluorescente 1 cm lateral da linha média e 1-2 cm anterior à articulação sacroilíaca. Insira a agulha 1 centímetro através da pele direcionado 45 ° medialmente. Use 1:50 diluição de partículas fluorescentes ou sozinho PBS como controle. Incubar camundongos por tempo determinado antes da análise.
- Euthanize ratos de acordo com o cuidado de animais aprovados e usam protocolos da comissão. Injectar 10 ml de PBS para a cavidade peritoneal, utilizando uma seringa e agulha 12 mL 25G. Agite levemente carcaça longitudinalmente para um minuto. Recuperar suspensão de células de peritônio usando a mesma seringa e uma agulha de 16G em um tubo cônico de 15 mL e reserva no gelo, enquanto a dissecação de carcaça continua.
- Molhada no lado ventral da carcaça cuidadosamente com etanol 70%. Levante a pele na linha média logo abaixo da caixa torácica com uma pinça e corte uma pequena incisão através da pele com uma tesoura. A partir daí, fazer uma incisão centímetros 05/03 longa através da pele em ambos os sentidos a cabeça ea cauda, em seguida, dois 2 cm de incisões lateralmente da linha média de cada extremidade. Retire a pele e pinos para revelar as cavidades peritoneal e torácica. Corte cuidadosamente através das membranas translúcidas finas ao redor do peritônio e refletem o tórax para revelar o mediastino.
- Encontrar e remover 2-4 linfonodos mediastinais, ligeiramente dorsal e lateralmente adjacentes para o timo, medialmente adjacente à artéria braquiocefálica, perto do lado ventral da traquéia. Encontrar e remover até seis gânglios linfáticos mesentéricos, embutidos no tecido macio branco mesentérica, que ancora o intestino à parede abdominal posterior. Encontrar e remover o baço, um longo, vermelho escuro, órgão localizado apenas a lateral da linha média dorsal e para o intestino, no lado esquerdo do abdômen. Linfonodo de reserva em 1 mL RPMI 1640, em gelo até dissecção é completa.
- Macerado e pressione gânglios linfáticos através de uma peneira de malha 40 mM em 3 mL de RPMI em uma placa de Petri de plástico usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL. Enxágüe com um filtro de 2 mL de RPMI e transferir a suspensão celular 5 mL para um tubo cônico de 15 mL. Lavar a placa de Petri com um adicional de 5 mL de RPMI e transferência para o mesmo tubo. Centrifugar 5 minutos a 250 xg, elimine o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 mL FACS tampão (1X PBS, 1% de albumina bovina sérica e 10 mM EDTA) e transferir para um tubo Eppendorf 1,5 mL.
O seguinte é um protocolo de coloração típica para a identificação de subconjuntos de células imunes utilizando anticorpos fluorescentes contra bem caracterizados marcadores de superfície das células imunológicas. Todos os anticorpos foram diluídos em tampão FACS imediatamente antes da utilização.
- Contagem de células e alíquota de 10 6 células em tubos Eppendorf. Células de centrifugação (ver 2.7) e lavar pellet 2X com um tampão FACS mL.
- Incubar as células 20 min no gelo em 100 mL de 2 ng / mL do mouse anti-rato CD16/32 para bloquear os receptores Fc endógena. Pellet e células de lavagem com tampão FACS.
- Adicionar 100 mL de 1ng / mL apropriado anticorpos fluorescentes (y) s para cada amostra e incubar no gelo por uma hora. Adicionar 100 mL de tampão FACS sozinho para as células controle. Pellet e células lavar duas vezes com tampão FACS.
- Re-suspender as células em 1 mL de tampão ACK (150 mM NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 e 0,1 mM EDTA) Incubar em gelo por 1 min para lisar as células vermelhas do sangue. Pellet e células de lavagem com tampão FACS. Re-suspender as células em um buffer de FACS mL.
- Coletar dados a partir de células usando um citômetro de fluxo capazes de detecção e análise multicolor, tipicamente com 405, 488 e 633 nm de excitação e lasers 09:55 detectores de emissão de fluorescência.
4. Resultados representativos:
Nós purified varas prion de crude, prion infectados homogenato de cérebro (Figura 1) solubilização Detergente e ultracentrifugação dos alces E2 cérebro homogenato (faixas 1 e 2) grandemente enriquecido para hastes de prion (compare raias 1 e 3), que também foi protease K resistente (faixa 4). Curiosamente, não digerido varas prion purificada exibiu um perfil muito semelhante à glycoform homogeneizado digerida E2 cérebro, indicando enriquecimento dramático para príons. Homogenato de cérebro de forma idêntica tratados normais não produziu PK-resistente PrP C (faixas 5 e 6).
Análise de citometria de fluxo de populações de células específicas demonstram que as células apresentadoras de antígenos para casa para o peritônio em duas horas e reter partículas fluorescentes e barras de príon, como evidenciado por fluorescência aumentou dramaticamente ao longo controles PBS injetado (Figura 2). Não células colhidas do peritônio de PBS-tratados controles exibidos fluorescência acima de fundo (Figs. 2A-G), enquanto as células de talão (Figs. 2H-N) e prion (Figs. 2O-U)-inoculados camundongos exibido fluorescência significativa, especialmente em monócitos (Figs. 2I e P), células dendríticas (Figs. 2K e R) e macrófagos (Figs. 2L e S), e alguns neutrófilos (Figura 2J e Q) e menos células B (Figura 2T). Grânulo e Prion-rolamento monócitos, células dendríticas e macrófagos também foram encontrados nos gânglios linfáticos do mediastino duas horas após a inoculação (Figs. 2AD e AK, AF e AG e AM e AN, respectivamente), enquanto poucas ou nenhuma PrP CWD-bearing neutrófilos , as células B ou T foram encontradas lá (Figs. 2AE e AL, AH e AG e AI e AP, respectivamente). Nós não detectou contas ou varas príon no baço ou linfonodos mesentéricos (dados não mostrados). In totum, estes dados demonstram que o tráfego de células do sistema imunológico prions de forma muito semelhante aos antígenos de outras partículas.
| REAGENT | Fluorocromo | LASER excitação (nm) | Pico de emissão (nm) |
| Hastes príon | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 mM contas | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| Anticorpos | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Ficoeritrina-Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R-Ficoeritrina | 488 | 575 |
| Ficoeritrina-Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R-Ficoeritrina | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin-Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R-Ficoeritrina | 488 | 575 |
Figura 1. Purificação de varas prion de homogenato de cérebro infectado. Usamos um homogenato de cérebro de 10% bruto de um cervo CWD-infectados (E2, faixas 1 e 2) como matéria-prima da qual purificada varas prion agregado (faixas 3 e 4). Bruta e purificada materiais apresentaram resistência característica a protease K tratamento (faixas 1-4), enquanto homogenato de cérebro normal não (faixas 5 e 6). Marcadores de peso molecular são mostrados na Kd à esquerda da mancha. BH, homogenato de cérebro.
Figura 2. Citometria de fluxo imunológico prions tráfico células do peritônio para os gânglios linfáticos do mediastino duas horas após a inoculação. PBS (painéis AG e V-AB), partículas fluorescentes (HN e AC-AI) ou varas de Prion (OU e AJ-AP) foram injetado no peritônio de camundongos e células colhidas de lavado peritoneal (AU) ou linfonodos mediastinais (V-AP), duas horas mais tarde. Gráficos nas células primeira coluna show de camundongos tratados com PBS (painéis A e V), partículas fluorescentes (painel H e AC) e hastes de prion (painéis S e AJ). Células fluorescentes (pontos vermelhos ou verdes) e total de células (pontos cinza) são plotados para mostrar tamanho relativo de dispersão (para frente), granularidade de dispersão (lateral) e proporção do total de células vivas que apresentam fluorescência. Um número significativo de células característica de granulócitos retidos partículas fluorescentes e barras. Células também foram coradas com anticorpos contra marcadores de células imunes de superfície e fechado para LYG-Ly6C + monócitos (painéis B, I, P, W, AD e AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrófilos (C, J, Q, X, AE e AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + células dendríticas (D, K, R, Y, AF e AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrófagos, (E, L, S, Z, AG e AN), CD3 -B220 + CD21 + células B (F, M, T, AA, AH e AO) e CD21-B220-CD3 + células T (G, N, U, AB, AI e AP). Monócitos, células dendríticas e macrófagos retidas partículas fluorescentes e barras de prion na cavidade peritoneal (painéis I e P, K e L e R e S, respectivamente) e transportou-os para os gânglios linfáticos do mediastino (painéis AD e AK, AF e AG e AM e AN, respectivamente), demonstrando absorção semelhantes e tráfico destas duas partículas. Neutrófilos retidos uma quantidade significativa de contas (J) e hastes menos (Q), mas não conseguiu entregá-los para os nódulos linfáticos (AE e AL). Células B retido e transportado algumas hastes (T e AO), mas praticamente nenhum contas (M e AH). Células T traficadas nem contas nem varas (N, U, AI e AP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui demonstramos um protocolo para a marcação e rastreamento de prions in vivo que muito facilita o monitoramento de eventos no início de príons periféricos. Este protocolo aumenta muito em tentativas passadas de captação de prion de monitoramento in vitro 9 e in vivo 3,12 por pré-inóculo rotulagem prion altamente enriquecido para diferenciá-lo de forma inequívoca endógena PrP C. Porque príons infecciosos e PrP C compartilhar a mesma seqüência de ácido amino primário, gerando prion anticorpos específicos tem sido problemática. Temos realizado experiências semelhantes com camundongos injetados com nulo PrP PK-digeridos e metanol precipitado homogenato de cérebro de crude que rastreados usando Dylight 649-labelelled anti-PrP anticorpos (os nossos dados não publicados). Esses experimentos produziram resultados quase idênticos, como mostrado aqui, mas ratos PrP nulos não são disponíveis comercialmente, não suscetíveis à doença de príon 19 e falta o receptor de prion apenas bona fide conhecido, PrP C. Este protocolo permite o uso de cepas de laboratório comum do rato que expressam endógena PrP C, evitando possíveis problemas com ratos nulos PrP.
Os dados aqui apresentados indica que a captura de células do sistema imunológico e prions tráfego e partículas fluorescentes de forma semelhante, embora as células B foram identificados como tráfico o primeiro, mas não o último. Isso corrobora estudos anteriores células B implicando como traficantes de prion 6. No entanto, nossa preparação prion altamente enriquecido provavelmente contém pequenas quantidades de proteínas adicionais rotulado, por isso não podemos descartar a possibilidade de que as células imunológicas que o tráfego destas proteínas também. Se quantidades muito pequenas de contaminantes proteínas príon alter tráfico ou imita o cenário verdade biológica continua a ser determinado.
Acompanhamento eficaz de células imunes tráfico duas partículas diferentes sugere ainda que este protocolo pode ser adaptado a uma grande variedade de antígenos que podem ser etiquetados e controlados, tais como parasitas, bactérias, vírus e proteínas.
Ao executar as etapas de ultracentrifugação neste protocolo, grandes volumes de amostra podem ser aliquotado para menores de centrifugação conveniente, desde que razões permanecem constantes. Por exemplo, em vez de camadas 100 mL de amostra de mais de 900 mL de sacarose, pode-se camada de 10 mL de 90 mL em tubos separados, então centrífuga.
Elevando o mouse posteriormente durante inoculações move órgãos peritoneal anterior, minimizando ferimentos acidentais a eles. Lenta e cuidadosamente inserir agulhas quando inoculação de camundongos e de injeção e aspiração PBS do peritônio para evitar a ruptura dessa membrana delicada.
Ao dissecar ratos, ter o cuidado de cortar apenas que a pele das incisões iniciais, deixando a fina membrana que cobre o peritônio e mediastino intacto, para evitar o corte dos vasos sanguíneos e órgãos que podem interferir com a identificação de linfonodos e recuperação.
Linfonodos pode ser difícil identificar inicialmente, muitas vezes parecendo tecido adiposo. Linfonodos aparecem quase redondo, de cor branca a creme e mais firme do que o tecido adiposo. Estes tornam-se muito mais fácil identificar com a prática. Nós piscina linfáticos de pelo menos dois ratos para recuperar células suficientes para análises de citometria de fluxo.
Para simultaneamente identificar marcadores de superfície de células múltiplas, recomendamos o uso de anticorpos fluorescentes mais anticorpos unlabeled que exigem um anticorpo secundário anti-isotipo fluorescentes para detecção, como o último projeto experimental exige seleção cuidadosa dos anticorpos gerados a partir de múltiplas espécies e muitas mais amostras adicionais de controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Steve McBryant e Jeff Hansen para ajudar com ultracentrifugação e Kiser Patti para ajudar no tratamento de mouse. O Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrames no National Institutes of Health, conceder 5R01NS056379-02 financiado este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
