Summary
在这里，我们描述了一种新的分析监测朊蛋白的吸收和免疫细胞的活动，通过净化后立即腹腔注射和荧光标记从被感染的大脑，然后监测其吸收和运动从注射部位和调解这些事件的细胞特征的材料汇总朊病毒棒。
Abstract
异常的形式存在的主机编码朊蛋白（PrPC）是蛋白酶耐，病理和传染性的朊病毒疾病，如慢性消耗病（CWD）鹿和羊痒病的特征。断言，这种不正常的构象构成的大部分或全部的传染性朊病毒，朊病毒假说。的免疫系统在外围朊病毒的发病机制中的早期事件中的作用已令人信服地证明 CWD和痒病1-3。在保留和复制朊病毒感染后4-6年初，在小鼠的基因和药理学研究发现补体系统的重要作用 。7-10树突状细胞在体外和体内研究也观察到朊病毒保留，尽管他们在贩卖的作用仍然不清楚11-16。巨噬细胞也同样被牵连在早期朊病毒的发病机制，但这些研究都集中在事件发生后感染3,11,17周。这些以前的研究也受到来自内源性的PrP C和传染性朊病毒之间的区别问题。在这里，我们描述了一个半定量的评估接种部位招募免疫细胞朊蛋白的吸收和贩运，不带偏见的方法。从被感染的脑组织匀浆洗涤剂溶解非聚合蛋白，通过蔗糖垫层离心纯化聚合朊病毒棒。聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色和免疫印迹证实颗粒分数高浓缩铀的朊病毒棒的回收。朊病毒棒荧光标记，然后注射到小鼠腹腔内。两个小时后测定腹腔灌洗液，脾，纵隔，肠系膜淋巴结的免疫细胞朊病毒杆保留和多色流量使用单核细胞，中性粒细胞，树突状细胞，巨噬细胞和B细胞和T细胞的标记流式细胞仪确定的细胞亚群。此试验允许首次直接监测的免疫收购细胞，感染后数小时内贩运朊病毒在体内。此实验也明确区分汇总朊病毒的传染性，从PrPC通常在宿主细胞中所表达的，可困难，并导致其他检测系统中的数据解释问题。可以适应其他接种途径（口服，静脉，intranervous和皮下，如）和抗原（共轭珠，细菌，病毒和寄生虫病原体和蛋白质，鸡蛋），以及该协议。
Protocol
1。净化和标签朊病毒棒
该协议是改编自一个以前出版了18本
- 在900毫升的冰冷的均质缓冲朊病毒感染的脑组织匀浆100克（HB，1X PBS含320毫米蔗糖，氯化钠150毫米和4毫米EDTA）1分钟，最大速度在商业搅拌机，然后在冰上2分钟。重复三次。
- 在3000 XG 10分钟和4 ° C离心匀浆删除，并保存在冰上清。重新悬浮颗粒在1L HB和重复步骤1.1和1.2。
- 池上清液和离心100000 XG，0 ° C 60分钟弃上清。
- 重新悬浮颗粒在100毫升的1X三缓冲液（10毫米的Tris - HCl，氯化钠0.1毫米和1毫米EDTA）含2％Triton X - 100的的（TBST）。布拉德福德或类似的实验估计蛋白浓度调整至5毫克/毫升在TBST。冰浴30分钟。
- 100000 XG，0 ° C离心30分钟弃去上清液，沉淀用50毫升TBST 100毫升的TBS。重新悬浮颗粒在100 mL 1X PBS中含1％sarcosyl和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和120分钟的搅拌，在37 ° C。
- 900毫升蔗糖320毫米和60分钟的离心样品10万，10 ° C XG层弃上清，重新悬浮颗粒在2.3M氯化钠10毫升，5％sarcosyl。
- 超声在70％的最大功率在1分钟间隔冰样本5 × 40秒。
- 分装1毫升样品到Eppendorf管和离心13000 XG，摄氏4度15分钟。洗净用TBS和存储颗粒的两倍@ -70 ° C或共轭荧光步骤1.9。
- 共轭1管纯化的朊蛋白棒，使用1小瓶DyLight 649荧光，根据制造商的协议。
- 交易所DyLight标签对PBS缓冲液透析或通过离心过滤列。商店在20μL分装在-70℃避光，直到准备使用。
2。朊病毒接种和细胞恢复
本节包括朊病毒接种腹腔和腹膜，纵隔，肠系膜淋巴结和脾脏细胞的恢复。
- 稀释荧光朊病毒棒的PBS 1:50之前使用。用拇指和食指背侧颈部皮毛颈背鼠标，轻轻转动鼠标，面对你和约束小指尾。旋后鼠标，提升头以上的后腿躯干和他略有倒挂。
- 使用30G的胰岛素注射器，注入100μL荧光朊病毒棒中线和骶髂关节前1-2厘米的外侧1厘米。插入针经皮肤1厘米的内侧45 °。使用1:50稀释的荧光珠或PBS单独作为对照。分析前的时间分配，孵育小鼠。
- 安乐死小鼠根据经批准的动物护理和使用委员会的协议。使用12 ml注射器和25G针进入腹膜腔注入10毫升的PBS。轻轻摇动胴体纵向一分钟。在冰上使用相同的注射器和16G针到15 mL锥形管和储备，而胴体的不断清扫腹膜恢复细胞悬液。
- 用70％乙醇彻底湿润的胴体的腹侧方。电梯在正下方用钳胸腔中线的皮肤，并通过皮肤用剪刀切一个小切口。有开始，通过在两个方向上的头部和尾部的皮肤3-5厘米长的切口，然后从每端两个2厘米的切口从中线横向。剥开针皮肤揭示腹腔和胸腔。小心地穿过薄的半透明膜周围的腹膜，反映胸廓的揭示纵隔。
- 查找和删除2-4纵隔淋巴结肿大，稍背和横向相邻胸腺，靠近气管的腹内侧相邻臂动脉，。查找并删除六个肠系膜淋巴结，嵌在柔软的白色肠系膜组织肠子锚后腹壁。查找并删除脾，位于中线外侧和背在左侧腹部的肠子长，暗红色的器官。储备淋巴结清扫术是在1 mL的RPMI 1640培养基在冰上，直到完成。
- 浸渍，并通过40微米到3毫升的RPMI网状过滤器在一个塑料的Petri菜用1 mL注射器的柱塞按淋巴结。冲洗过滤器和一个额外的2毫升的RPMI 5 mL细胞悬液转移到15 mL锥形管。额外的5毫升的RPMI冲洗培养皿转移到同一管内。 250 XG离心5分钟，弃上清，重新悬浮细胞沉淀在1 mL流式细胞仪缓冲液（1 × PBS，1％牛血清白蛋白和10 mM EDTA）和转移到1.5 mL Eppendorf管。
下面是一个典型的染色协议确定对良好的免疫细胞表面标记的荧光抗体的免疫细胞亚群。使用前，所有的抗体流式细胞缓冲液稀释成。
- 到Eppendorf管中的细胞和分装10 6细胞计数。离心机细胞（见2.7）和流式细胞仪用1 mL缓冲液洗颗粒2X。
- 孵育细胞在冰上20分钟，在100μL2毫微克/毫升的鼠抗鼠CD16/32以阻断内源性的Fc受体。沉淀和流式细胞仪缓冲液洗细胞。
- 加入100μL1ng /毫升适当的荧光antibod（Y）IES每个样品在冰上培育一个小时。添加100μL流式细胞仪缓冲单独控制细胞。沉淀和洗涤细胞与流式细胞仪缓冲两次。
- 在1毫升ACK缓冲液（150毫米，1毫米KHCO 3和0.1毫米EDTA的NH 4 CL）1分钟，以溶解红细胞冰孵育细胞，重新挂起。沉淀和流式细胞仪缓冲液洗细胞。 1毫升流式细胞仪缓冲液重悬细胞。
- 收集细胞，使用流式细胞仪多色检测和分析的能力，通常与405，488和633 nm激发激光器和五至十年的荧光发射探测器的数据。
4。代表性的成果：
从原油中分离纯化棒朊病毒，朊病毒感染的脑组织匀浆（ 图1）洗涤剂溶解和E2的麋鹿脑组织匀浆离心（ 泳道1和2）极大地丰富了朊病毒棒（比较泳道1和3），这也是蛋白酶K耐（4车道）。有趣的是，未消化的纯化朊病毒棒显示一个glycoform轮廓惊人地相似，消化E2的脑组织匀浆，表明朊病毒戏剧性的浓缩。相同处理的正常脑组织匀浆产生任何的PK抗性的PrP C（5和6） 。
流的特定细胞群的流式细胞仪分析表明，抗原提呈细胞两小时回家腹膜和留住荧光珠和朊病毒棒，大大增加了PBS注射控制荧光（ 图 2）证明。从上述背景荧光（ 图2A - G）的显示控制PBS治疗腹膜收获细胞，而细胞珠（ 图2H - N）和朊病毒（ 图2O - U）接种小鼠显示显着的荧光，特别是在单核细胞（图2I和 P），树突状细胞（图2K和 R）和巨噬细胞（图2L和 S），和一些中性粒细胞（图2J和Q）和B 细胞较少 （图2T）。珠和朊病毒轴承单核细胞，树突状细胞和巨噬细胞中也发现了两小时后接种（ 图2AD和AK，自动对焦和AM和AG和AN，分别），而很少或根本没有的PrP CWD的轴承中性粒细胞的纵隔淋巴结，B或T细胞被发现（ 图2AE和AL，AH和AG和AI和AP，分别）。我们没有发现珠脾或肠系膜淋巴结（数据未显示）或朊病毒棒。在TOTO，这些数据表明，免疫细胞的朊病毒交通非常类似于其他微粒抗原。
| 试剂 | 荧光 | 激发光（NM） | 峰值发射（纳米） |
| 朊病毒棒 | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1微米的小珠 | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| 抗体 | |||
| CD11b的 | eFluor 450 | 405 | 450 |
| 藻红蛋白- Cy7 | 488 | 760 | |
| 的CD11c | R -藻红蛋白 | 488 | 575 |
| 藻红蛋白- Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R -藻红蛋白 | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | 变藻蓝蛋白，Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R -藻红蛋白 | 488 | 575 |
图1。从被感染的脑组织匀浆的朊病 毒棒净化我们从感染CWD的鹿（E2，1和2车道）作为起始原料，从中我们纯化汇总朊病毒棒（泳道3和4）10％的原油脑组织匀浆。原油和纯化的材料表明：蛋白酶K处理的特性阻抗（1 - 4车道），而正常脑组织匀浆不（5和6车道）。 Kd以印迹左侧分子量标记显示。波黑，脑组织匀浆。
图2。流式细胞仪分析免疫细胞贩运朊病毒从腹膜，纵隔淋巴结肿大，两小时后接种 。PBS（板公司的V - AB），荧光珠（HN和AC - AI）或朊病毒杆（OU和AJ - AP ）注入小鼠腹腔灌洗液（非盟）或纵隔淋巴结肿大（V型AP），两小时后收获细胞腹膜。图中的第一列显示细胞治疗的小鼠与PBS（面板A和V），荧光珠（面板H和AC）和朊病毒棒（板O和AJ）。绘制荧光细胞（红色或绿色的点）和总细胞数（灰色点）显示的相对规模（前向散射），粒度（侧散射）和总活细胞，荧光的比例。粒细胞特征的细胞大量保留了荧光珠和棒。细胞是还沾有抗免疫细胞表面标志物，并为连云港的Ly6C +单核细胞门（板B，I，P，W，公元和AK），Ly6c -的CD11c的细胞CD11b + Ly6G +中性粒细胞（C，J，Q，X，自动曝光的抗体和AL），Ly6G - Ly6C -细胞CD11b +的CD11c +树突状细胞（ð，K，R，Y，自动对焦和下午），Ly6G - Ly6C -的CD11c的细胞CD11b +巨噬细胞，（发送，大号，小号，ž，公司和AN），CD3 + - B220 + CD21 + B细胞（F，M，T，AA，AH和AO）和CD21 - B220 - CD3 + T细胞（G，N，U，AB，AI和AP）。单核细胞，树突状细胞和巨噬细胞保留在腹腔内（板我和P，K和R和L和S，分别）荧光珠和朊病毒棒和运输纵隔淋巴结（AD和AK面板，自动对焦和AM和AG分别），表现出类似的摄取这两种微粒和贩运。中性粒细胞保留了大量的珠（J）和较少的杆（Q）的，但没有提供他们淋巴结（AE和AL）。 B细胞保留，并运送一些棒（T和AO），但几乎没有珠（M和AH）。 T细胞被贩卖既不珠也不棒（N，U，AI和AP）。
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Discussion
在这里，我们展示了一个标记和跟踪朊病毒的协议 ，在体内，大大方便了监控周边朊病毒感染的早期事件。该协议大大提高了监测朊病毒吸收过去的尝试标签前的高浓缩铀朊病毒接种 9体外和 体内 3,12明确区分内源性的PrP彗星。由于传染性朊病毒PrP的彗星共享相同的主要的氨基酸序列，产生朊蛋白的特异性抗体一直是个问题。我们已经执行了类似的实验，使用PK的消化和甲醇沉淀原油的脑组织匀浆，我们跟踪使用Dylight 649 - labelelled抗PrP抗体（未发表资料）的PrP空小鼠注射。这些实验几乎相同的结果如下所示，但小鼠的PrP空是不是商业化，不容易受到朊病毒疾病的19和缺乏只有真正的朊蛋白受体称为PrP 的彗星。此协议允许使用共同的实验室小鼠品系，表达内源性的PrP C，无须使用的PrP null小鼠的潜在问题。
这里显示的数据表明，免疫细胞的采集和交通朊病毒和荧光珠同样，尽管B细胞被确定为贩卖前者而不是后者。这证实了以往的研究朊病毒毒贩6牵连乙细胞。然而，我们的高度浓缩的朊病毒准备可能包含额外的标记蛋白质的微量，因此我们不能排除这种可能性，免疫细胞，这些蛋白质交通。无论是极少量的污染蛋白改变朊病毒贩卖或模拟真实的生物方案仍有待确定。
进一步表明，这个协议可以适应各种各样的抗原，可标记和跟踪，如寄生虫，细菌，病毒和蛋白质，免疫细胞贩运两个不同的微粒成功监测。
当执行这个协议的离心步骤，可以分装的大样本量较小的离心方便，只要比率保持不变。例如，超过900毫升蔗糖的100 mL样品，而不是分层，可以在单独的管层超过90毫升10毫升，然后离心。
在接种提升向后移动鼠标腹腔器官前方，尽量减少意外针刺伤。慢慢地，小心地插入针接种小鼠和从腹膜注射和吸PBS，以避免这种微妙的膜破裂。
当解剖小鼠，照顾削减虽然在最初的切口的皮肤，离开腹膜和纵隔完好的薄膜覆盖，以避免切割的血管和器官，可能会干扰淋巴结识别和检索。
淋巴结可最初难以辨认，往往喜欢寻找脂肪组织。淋巴结出现近圆形，白色至奶油色的，比脂肪组织更加坚定。这些变得更加容易识别与实践。至少有两只老鼠的游泳池淋巴结恢复足够的细胞，流式细胞仪分析。
同时识别多个细胞表面标志，我们强烈建议使用需要一个次要的荧光反亚型抗体检测未标记抗体，荧光抗体，因为后者的实验设计需要谨慎选择从多个物种和许多额外的控制样品产生的抗体。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢史蒂夫McBryant和杰夫汉森鼠标操作的帮助与超速离心和帕蒂凯泽帮助。授予5R01NS056379 - 02在美国国立卫生研究院，美国国家神经疾病和中风研究所资助的这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
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