Summary
Qui si descrive un nuovo metodo di analisi per monitorare l'assorbimento del prione e del traffico da parte delle cellule immunitarie subito dopo l'inoculazione intraperitoneale purificando e fluorescente etichettatura aste prioni aggregati da materiale cerebrale infetto allora monitoraggio loro adozione, e il movimento dal sito di iniezione e caratterizzare le cellule che mediano questi eventi.
Abstract
Presenza di una forma anomala di un host codifica della proteina prionica (PrPc) che è resistente alle proteasi, patologica e contagiosa che caratterizza le malattie da prioni come la sindrome del dimagrimento cronico (CWD) di cervidi e la scrapie nelle pecore. L'ipotesi da prioni afferma che questo conformero anomala costituisce la maggior parte o tutti i prioni infettivi. Il ruolo del sistema immunitario in eventi precoci nella patogenesi dei prioni periferici è stata dimostrata in modo convincente per la malattia del dimagrimento cronico e scrapie 1-3. Transgeniche e studi farmacologici nei topi hanno rivelato un ruolo importante del sistema del complemento a mantenere e replicare i prioni presto dopo l'infezione 4-6. In vitro e in studi in vivo hanno anche osservato la conservazione dei prioni da parte delle cellule dendritiche 7-10, anche se il loro ruolo nel traffico resta chiaro 11-16. I macrofagi sono similmente stati implicati nella patogenesi prioni presto, ma questi studi si sono concentrati sugli eventi che si verificano settimane dopo l'infezione 3,11,17. Questi studi precedenti inoltre hanno il problema di distinguere tra endogena PrP C e prioni infettivi. Qui descriviamo una semiquantitativo, approccio imparziale per valutare l'assorbimento del prione e il traffico dal sito di inoculazione da parte delle cellule immunitarie reclutate lì. Aste dei prioni aggregati sono stati purificati da omogenato cerebrale infetto da solubilizzazione di detergente non aggregata proteine e ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio. Poliacrilammide gel elettroforesi, colorazione Coomassie blu e occidentale recupero blotting confermato di aste prioni altamente arricchito nella frazione pellet. Aste prioni sono stati marcati con fluorocromi intraperitoneale poi iniettato in topi. Due ore dopo, cellule immunitarie dal liquido di lavaggio peritoneale, nella milza e nei linfonodi mediastinici e mesenterici sono stati analizzati per la ritenzione del prione asta e sottoinsiemi di cellule identificate mediante citometria di flusso multicolore utilizzando marcatori per i monociti, i neutrofili, cellule dendritiche, macrofagi e delle cellule B e T. Questo test permette di monitorare in tempo prima diretta di cellule immunitarie acquisizione e il traffico di prioni in vivo poche ore dopo l'infezione. Questo test inoltre differenzia chiaramente infettive, aggregati da prioni PrPC normalmente espressa sulle cellule ospite, che può essere difficile e portare a problemi di interpretazione dei dati nei sistemi di dosaggio altri. Questo protocollo può essere adattato alle altre vie di inoculazione (orale, endovenosa, intranervous e sottocutaneo, ad esempio) e gli antigeni (perline coniugato, agenti patogeni batterici, virali e parassitarie e proteine dell'uovo) pure.
Protocol
1. Purificante e etichettatura Rods prioni
Questo protocollo è adattato da quello precedentemente pubblicato 18
- Omogeneizzare 100 grammi di prioni infetti tessuto cerebrale in 900 ml di buffer di ghiaccio freddo omogeneizzazione (HB, 1X PBS contenente 320 mM saccarosio, 150 mM NaCl e 4mm EDTA) 1 min alla massima velocità in una pubblicità frullatore, poi 2 minuti sul ghiaccio. Ripetete tre volte.
- Centrifuga omogenato per 10 min a 3000 xg e 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sul ghiaccio. Risospendere pellet in 1L HB e ripetere i punti 1.1 e 1.2.
- Surnatanti piscina e centrifugare per 60 minuti a 100.000 xg, 0 ° C. Gettare il surnatante.
- Risospendere pellet in 100 ml di soluzione salina tamponata Tris 1X (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl, 1 mM EDTA) contenente 2% Triton X-100 (TBST). Stima concentrazione di proteine da Bradford o test simili e regolare a 5 mg / ml in TBST. Freddo in ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare per 30 min a 100.000 xg, 0 ° C. Gettare il surnatante e lavare pellet con 50 mL TBST poi 100 mL TBS. Risospendere pellet in 100 ml di PBS 1X contenente l'1% sarcosyl e cocktail inibitore della proteasi e mescolate per 120 minuti a 37 ° C.
- Strato del campione su 900 ml di 320 mM saccarosio e centrifugare per 60 minuti a 100.000 xg, 10 ° C. Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml 2.3M NaCl, 5% sarcosyl.
- Sonicare campione di 5 x 40 secondi alla potenza massima del 70% a intervalli di 1 min sul ghiaccio.
- Aliquota 1 ml di campione in provette Eppendorf e centrifugare per quindici minuti a 13.000 xg, 4 ° C. Lavare pellet due volte con TBS e conservare @ -70 ° C o coniugato al fluorocromo al punto 1.9.
- Coniugato 1 tubo di purificato aste dei prioni con 1 fiala di DyLight 649 fluorocromo secondo il protocollo del produttore.
- Scambio DyLight tampone di etichettatura per PBS da dialisi o centrifugazione attraverso le colonne del filtro. Conservare in 20 microlitri aliquote a -70 ° C al riparo dalla luce fino al momento dell'uso.
2. Prioni inoculazione e recupero cellulare
Questa sezione comprende l'inoculazione intraperitoneale prioni e il recupero di cellule dal peritoneo, linfonodi mediastinici e mesenterici e la milza.
- Diluire aste prioni fluorescenti 1:50 in PBS immediatamente prima dell'uso. Topo collottola dal collo di pelliccia dorsale con pollice e indice, delicatamente girare mouse per affrontare voi e frenare la coda con il dito mignolo. Supinazione del mouse, elevando torso posteriori sopra la testa e tenendolo un po 'a testa in giù.
- Utilizzando una siringa per insulina 30G, iniettare 100 ml di aste prioni fluorescente 1 cm lateralmente alla linea mediana e 1-2 cm anteriormente alla sacroiliaca. Inserire l'ago 1 centimetro attraverso la pelle rivolta a 45 ° medialmente. L'uso diluizione 1:50 di perline fluorescenti o PBS solo come controlli. Incubare i topi per il tempo assegnato prima dell'analisi.
- Euthanize topi secondo la cura degli animali approvato ed utilizzano protocolli commissione. Iniettare 10 ml di PBS nella cavità peritoneale con una siringa da 12 ml e ago 25G. Scuotere delicatamente carcassa longitudinalmente per un minuto. Recuperare sospensione cellulare dal peritoneo utilizzando la stessa siringa e un ago 16G in un tubo da 15 ml e riserva sul ghiaccio mentre dissezione della carcassa continua.
- Bagnare la parte ventrale della carcassa accuratamente con etanolo al 70%. Sollevare la pelle sulla linea mediana appena sotto la gabbia toracica con una pinza e tagliate una piccola incisione attraverso la pelle con le forbici. A partire lì, fare una incisione lungo 3-5 centimetri tra la pelle in entrambe le direzioni a testa e la coda, poi due incisioni di 2 cm dalla linea mediana lateralmente da ciascuna estremità. Staccare la spina e pelle per rivelare la cavità peritoneale e toracica. Con attenzione tagliare le sottili membrane traslucide che circondano il peritoneo e riflettono il torace per rivelare il mediastino.
- Individuare e rimuovere 2-4 linfonodi mediastinici, leggermente dorsale e lateralmente adiacente al timo, medialmente adiacente all'arteria brachiocefalica, vicino al lato ventrale della trachea. Individuare e rimuovere i nodi fino a sei linfonodi mesenterici, incorporati nel tessuto molle mesenterica bianco che ancora l'intestino alla parete addominale posteriore. Individuare e rimuovere la milza, un lungo organo rosso scuro situato laterale della linea mediana e dorsale per l'intestino nella parte sinistra dell'addome. Linfonodi riserva in 1 ml di RPMI 1640 medium in ghiaccio fino dissezione è completa.
- Macerare e premere linfonodi attraverso un filtro di 40 micron in 3 mL di RPMI in una capsula di Petri di plastica con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Sciacquare il filtro con un ulteriore 2 ml di RPMI e trasferire i 5 ml di sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Sciacquare la piastra Petri con altri 5 ml di RPMI e trasferimento al tubo stesso. Centrifugare 5 min a 250 xg, scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml FACS tampone (PBS 1X, 1% di albumina sierica bovina e 10 mM EDTA) e trasferire in una provetta da 1,5 ml Eppendorf.
Il seguente è un protocollo di colorazione tipica per identificare sottogruppi di cellule immunitarie utilizzando anticorpi fluorescenti contro marcatori cellulari ben caratterizzati immunitario di superficie. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in tampone FACS immediatamente prima dell'uso.
- Contare le celle e aliquota 10 6 cellule in provette Eppendorf. Cellule centrifuga (vedi 2.7) e lavare pellet 2X con 1 mL di tampone di FACS.
- Incubare cellule di 20 minuti sul ghiaccio in 100 l di 2 ng / mL ratto anti-topo CD16/32 di bloccare i recettori Fc endogena. Pellet e le cellule lavare con tampone FACS.
- Aggiungere 100 ml di 1NG / mL appropriati anticorpi fluorescenti (y) IES ad ogni campione e incubare in ghiaccio per un'ora. Aggiungere 100 ml di buffer di FACS solo alle cellule di controllo. Pellet e le cellule lavare due volte con tampone FACS.
- Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di ACK (150 mm NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 e 0.1 mM EDTA) Incubare in ghiaccio per 1 min per lisare i globuli rossi. Pellet e le cellule lavare con tampone FACS. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di FACS.
- Raccogliere i dati dalle cellule utilizzando un citometro a flusso multicolore capace di rilevazione e di analisi, tipicamente con laser 405 nm, 488 e 633 eccitazione e 09:55 rilevatori di emissioni di fluorescenza.
4. Rappresentante dei risultati:
Siamo purificati da prioni aste greggio, prioni infetti omogenato cerebrale (figura 1) solubilizzazione Detergente e ultracentrifugazione del alce E2 cervello omogenato (corsie 1 e 2) notevolmente arricchito per aste dei prioni (confrontare corsie 1 e 3), che è stato anche proteasi K resistente (corsia 4). È interessante notare che non digerito aste dei prioni purificata mostrato un profilo di glycoform sorprendentemente simile a omogenato E2 digerito cervello, indicando arricchimento drammatico per i prioni. Identicamente trattati con omogenato di cervello normale non ha prodotto PK-resistente PrP C (corsie 5 e 6).
Citometria a flusso di popolazioni di cellule specifiche dimostrare che le cellule presentanti l'antigene casa al peritoneo di due ore e conservare perline fluorescenti e bacchette prioni, come evidenziato dalla fluorescenza drammaticamente aumentata durante i controlli PBS iniettato (Figura 2). Nessun cellule raccolte dal peritoneo di PBS trattati con comandi visualizzati sopra fluorescenza di fondo (Fig. 2A-G), mentre le cellule da cordone (Fig. 2H-N) e prioni (Fig. 2O-U)-inoculato nei topi visualizzata fluorescenza significativo, soprattutto sui monociti (Fig. 2I e P), le cellule dendritiche (Fig. 2K e R) e macrofagi (Fig. 2L e S), e alcuni neutrofili (Figura 2J e Q) e un minor numero di cellule B (2T Figura). Perline e prioni portante monociti, le cellule dendritiche ei macrofagi sono stati trovati anche nei linfonodi mediastinici due ore dopo l'inoculazione (Fig. 2AD e AK, AF e AM e AN e AG, rispettivamente), mentre poche o nessuna PrP CWD-cuscinetto neutrofili , le cellule B o T sono stati trovati lì (fig. 2AE e AL, AH e AI e AG e AP, rispettivamente). Abbiamo rilevato nessun perline o aste dei prioni nella milza e nei linfonodi mesenterici (dati non riportati). In toto, questi dati dimostrano che le cellule immunitarie traffico prioni in modo molto simile agli antigeni altre particelle.
| REAGENTE | Fluorocromo | ECCITAZIONE LASER (nm) | Picco di emissione (nm) |
| Prioni aste | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 perline micron | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| Anticorpi | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Ficoeritrina-Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R-ficoeritrina | 488 | 575 |
| Ficoeritrina-Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R-ficoeritrina | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin-Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R-ficoeritrina | 488 | 575 |
Figura 1. Purificazione di canne da prioni omogenato cerebrale infetto. Abbiamo usato un 10% omogenati cerebrali greggio da un CWD infetti cervo (E2, corsie 1 e 2) come materiale di partenza da cui ci purificati aste prioni aggregati (corsie 3 e 4). Entrambi i materiali grezzi e purificati hanno mostrato resistenza caratteristica a proteasi K trattamento (corsie 1 - 4), mentre omogenato cerebrale normale non (corsie 5 e 6). Marcatori peso molecolare sono riportate nella Kd a sinistra della macchia. BH, omogenato cerebrale.
Figura 2. Analisi di citometria a flusso di traffico di cellule immunitarie prioni dal peritoneo ai linfonodi mediastinici due ore dopo l'inoculazione. PBS (pannelli AG e V-AB), perline fluorescenti (HN e AC-AI) o di bacchette da prioni (OU, e AJ-AP) sono stati iniettate nel peritoneo di topi e le cellule raccolte dal liquido di lavaggio peritoneale (AU) o linfonodi mediastinici (V-AP), due ore dopo. Grafici nel prime cellule mostrano colonna da topi trattati con PBS (pannelli A e V), perline fluorescenti (pannello H e AC) e aste dei prioni (pannelli O e AJ). Cellule fluorescenti (punti rossi o verdi) e le cellule totale (punti grigi) vengono riportati per mostrare dimensione relativa (scatter in avanti), granularità (scatter lato) e la proporzione del totale delle cellule vive che fluorescenza. Un significativo numero di cellule caratteristico dei granulociti mantenuto perline fluorescenti e bacchette. Le cellule sono state anche colorate con anticorpi contro marcatori immunitari superficie cellulare e gated per LYG-Ly6C + monociti (pannelli B, I, P, W, AD e AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrofili (C, J, Q, X, AE e AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + cellule dendritiche (D, K, R, Y, AF e AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrofagi, (E, L, S, Z, AG e AN), CD3 -B220 + CD21 + cellule B (F, M, T, AA, AH e AO) e CD21-B220-cellule T CD3 + (G, N, U, AB, AI e AP). Monociti, le cellule dendritiche ei macrofagi mantenuto perline fluorescenti e aste dei prioni nella cavità peritoneale (pannelli di I e P, K e R e L e S, rispettivamente) e trasportati a linfonodi mediastinici (pannelli dC e AK, AF e AM e AG e AN, rispettivamente), dimostrando l'assorbimento simili e il traffico di queste due particelle. Neutrofili mantenuto una notevole quantità di perle (J) e un minor numero di aste (Q), ma non è riuscito a consegnarli ai linfonodi (AE e AL). Cellule B conservati e trasportati alcune aste (T e AO), ma praticamente nessun perle (M e AH). Le cellule T di traffico né perle né barre (N, U, AI e AP).
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Discussion
Qui mostriamo un protocollo per il tagging e prioni monitoraggio in vivo che facilita notevolmente il monitoraggio eventi precoci nelle infezioni da prioni periferici. Questo protocollo migliora significativamente i tentativi passati a monitorare l'assorbimento del prione in vitro 9 e in vivo da 3,12 pre-etichettatura inoculo prione altamente arricchito per inequivocabilmente lo differenziano da PrP C endogena. Poiché i prioni infettivi e PrP C condividono la stessa sequenza aminoacidica primaria, generando prioni anticorpi specifici è stato problematico. Abbiamo effettuato esperimenti simili utilizzando topi nulli PrP iniettati con PK-digerito e metanolo precipitato omogenato grezzo cervello che seguire con Dylight 649-labelelled anticorpi anti-PrP (i nostri dati non pubblicati). Questi esperimenti hanno prodotto risultati quasi identici come mostrato qui, ma PrP topi null non sono disponibili in commercio, non suscettibile di malattia da prioni 19 e la mancanza del recettore solo in buona fede da prioni noto, PrP C. Questo protocollo permette l'uso di ceppi comune topo di laboratorio che esprimono endogena PrP C, eliminando potenziali problemi con i topi nulli PrP.
I dati riportati qui indica che catturano le cellule immunitarie e prioni traffico e perline fluorescenti in modo simile, anche se le cellule B sono stati identificati come il traffico i primi e non la seconda. Questo conferma precedenti studi che coinvolgono le cellule B come trafficanti prione 6. Tuttavia, la nostra preparazione prioni altamente arricchito probabilmente contiene piccole quantità di ulteriori proteine marcate, quindi non possiamo escludere la possibilità che le cellule immunitarie traffico queste proteine troppo. Se piccole quantità di proteine contaminanti alterano il traffico di prione o imita lo scenario vero biologico rimane da determinare.
Monitoraggio di successo di cellule immunitarie traffico di due particelle diverse suggerisce inoltre che questo protocollo può essere adattato a una vasta gamma di antigeni che possono essere etichettati e monitorati, come parassiti, batteri, virus e proteine.
Quando si eseguono operazioni ultracentrifugazione in questo protocollo, volumi di campione di grandi dimensioni possono essere aliquotati a quelli più piccoli per centrifugazione conveniente fino a quando i rapporti rimangono costanti. Per esempio, invece di stratificazione 100 mL di campione oltre 900 ml di saccarosio, si potrebbe strato di 10 ml oltre 90 ml in tubi separati, quindi si centrifuga.
Elevando il mouse si sposta posteriormente durante vaccinazioni organi peritoneale anteriormente, riducendo al minimo ferite accidentali da ago a loro. Lentamente e con attenzione inserire gli aghi quando inoculando topi e iniettando ed aspirando PBS dal peritoneo per evitare questa rottura delicata membrana.
Quando dissezione topi, fare attenzione a tagliare solo se la pelle nelle incisioni iniziale, lasciando la sottile membrana che copre il peritoneo e mediastino intatto, per evitare di tagliare i vasi sanguigni e gli organi che possono interferire con l'identificazione dei linfonodi e il recupero.
I linfonodi possono essere difficili da identificare inizialmente, spesso guardando come tessuto adiposo. I linfonodi appaiono quasi rotondi, bianco sporco a crema e più solida rispetto al tessuto adiposo. Questi diventano molto più semplici da identificare con la pratica. Nodi linfatici piscina di almeno due topi di recuperare le cellule sufficiente per l'analisi di citometria di flusso.
Per simultaneously identifying multiple marcatori di superficie cellulare, si consiglia vivamente l'uso di anticorpi fluorescenti oltre antibodies senza etichetta che richiedono un secondario fluorescente contro-isotipo anticorpale per l'individuazione, la progettazione latter sperimentale prevede un'attenta selezione degli anticorpi generati da specie multiple e molti campioni di more ulteriore controllo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo McBryant Steve e Jeff Hansen aiuto per ultracentrifugazione e Patti Kiser aiuto per la gestione del mouse. L'Istituto Nazionale di Malattie neurologici e colpo al National Institutes of Health, concedere 5R01NS056379-02 finanziato questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
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