Summary
Här beskriver vi ett nytt test för övervakning av prioner upptag och handel av immunceller omedelbart efter intraperitoneal ympning av renande och fluorescerande märkning aggregerade prion spön från infekterade material från hjärnan sedan övervaka deras upptag och rörelse från injektionsstället och karaktärisera celler förmedla dessa händelser.
Abstract
Förekomst av en abnorm form en värd-kodad prionproteinet (PrPC) som är proteas resistenta, patologiska och smittsamma kännetecknar prionsjukdomar såsom Chronic Wasting Disease (CWD) av hjortdjur och scrapie hos får. Den Prion hypotesen hävdar att denna onormala fogar utgör de flesta eller alla av de smittsamma prioner. Roll i immunsystemet i början av händelser i perifera prion patogenes har övertygande visats för CWD och scrapie 1-3. Transgena och farmakologiska studier i möss visade en viktig roll i komplementsystemet i att behålla och replikera prioner tidigt efter infektionen 4-6. In vitro och in vivo-studier har också observerats prion behåller dendritiska celler 7-10, även om deras roll i handeln är fortfarande oklart 11-16. Makrofager har likaledes varit inblandade i början av prion patogenes, men dessa studier har fokuserat på händelser som inträffar veckor efter smittotillfället 3,11,17. Dessa tidigare studier lider också av problemet att skilja mellan endogena PrP C och smittsamma prioner. Här beskriver vi en semikvantitativ, objektiva tillvägagångssätt för att bedöma prioner upptag och människohandel från inokulationsstället av immunceller rekryteras dit. Aggregerad prion stavar var renat från infekterade hjärnan homogenatet av rengöringsmedel lösningsgörande av icke-aggregerade proteiner och ultracentrifugering genom ett sackaros kudde. Polyakrylamidgelelektrofores, coomassie blå färgning och Western blotting bekräftade återvinning av höganrikat prion spön i pelleterat fraktion. Prion stavar var fluorokrom-märkt sedan injiceras intraperitonealt på möss. Två timmar senare immunceller från peritoneal lavage, mjälten och mediastinum och kröslymfknutor analyserades för prioner spö lagring och delmängder cell identifieras med multicolor flödescytometri med hjälp av markörer för monocyter, neutrofiler, dendritiska celler, makrofager och B-och T-celler. Denna analys gör det möjligt för första gången direkt övervakning av immunceller förvärva och prioner människohandel in vivo inom några timmar efter infektion. Denna analys också tydligt skiljer smittsamma, aggregerade prioner från PrPC uttrycks normalt på värdceller, vilket kan vara svårt och leda till tolkning av data problem i andra test system. Detta protokoll kan anpassas till andra inokulering rutter (oral, intravenös intranervous och subkutan, t.ex.) och antigener (konjugerad pärlor, bakterier, virus och parasiter patogener och proteiner, ägg) också.
Protocol
1. Renande och märkning Prion Rods
Detta protokoll är anpassad från en tidigare publicerade 18
- Homogenisera 100 gram prion-infekterade hjärnvävnad i 900 ml iskall homogenisera buffert (HB, 1X PBS innehållande 320 mm sackaros, 150 mM NaCl och 4mm EDTA) 1 min vid maximal hastighet i en kommersiell mixer, sedan 2 min på is. Upprepa tre gånger.
- Centrifugera homogenatet i 10 min vid 3000 xg och 4 ° C. Avlägsna och spara supernatanten på is. Återsuspendera pelleten i 1L HB och upprepa steg 1,1 och 1,2.
- Pool supernatanterna och centrifugera i 60 minuter vid 100.000 xg, 0 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 100 ml 1X Tris saltlösning (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl och 1 mM EDTA) innehållande 2% Triton X-100 (TBST). Uppskatta protein koncentration av Bradford eller liknande analys och justera till 5 mg / ml i TBST. Chill på is i 30 min.
- Centrifugera 30 min vid 100 tusen xg, 0 ° C. Kassera supernatanten och tvätta pellets med 50 ml TBST sedan 100 ml TBS. Återsuspendera pelleten i 100 ml 1X PBS med 1% sarcosyl och proteashämmare cocktail och rör om i 120 min vid 37 ° C.
- Layer prov på 900 ml 320 mm sackaros och centrifugera i 60 minuter vid 100.000 xg, 10 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml 2,3 M NaCl, 5% sarcosyl.
- Sonikera prov 5 x 40 sekunder vid 70% maximal effekt på 1 min intervaller på is.
- Alikvotera 1 mL prov i Eppendorf-rör och centrifugera i femton minuter vid 13.000 xg, 4 grader Celsius. Tvätta pellets två gånger med TBS och förvara @ -70 ° C eller konjugat till fluorokrom i steg 1,9.
- Konjugat 1 tub renat prioner stavar med 1 injektionsflaska med DyLight 649 fluorokrom enligt tillverkarens protokoll.
- Börsen DyLight märkning buffert för PBS genom dialys eller centrifugering genom filtret kolumner. Förvaras i 20 mikroliter alikvoter vid -70 ° C borta från ljus tills det ska användas.
2. Prion Inokulation och Cell Recovery
Detta avsnitt omfattar intraperitoneal prioner ympning och återvinning av celler från bukhinnan, mediastinum och kröslymfknutor och mjälte.
- Späd fluorescerande prion stavar 1:50 i PBS omedelbart före användning. Nackskinnet mus med rygg-nacke päls med tummen och pekfingret, försiktigt vända musen för att möta dig och tygla svans med lillfingret. Supinate mus, upplyftande hind bål över huvudet och höll honom lite upp och ner.
- Med hjälp av en spruta 30G insulin, injicera 100 mikroliter av fluorescerande prioner stavar 1 cm i sidled av mittlinjen och 1-2 cm främre till sakroiliakaleden. Sätt nålen 1 cm genom huden riktas 45 ° medialt. Användning 1:50 spädning av fluorescerande pärlor eller PBS ensam som kontroller. Inkubera möss tilldelade tiden före analys.
- Euthanize möss enligt godkänd djurhållning och använda kommitténs protokoll. Injicera 10 mL PBS in i bukhålan med hjälp av en 12 ml spruta och 25G nål. Skaka stomme longitudinellt i en minut. Återhämta cellsuspension från bukhinnan med samma spruta och en 16G nål i en 15 ml koniska rör och reservera på is medan kadaver dissektion fortsätter.
- Blöt ventrala sidan av kroppen noggrant med 70% etanol. Lyft huden på mittlinjen strax under bröstkorgen med pincett och skär ett litet snitt genom huden med sax. Börja där, gör ett 3-5 cm långt snitt genom huden från i båda riktningarna till huvud och svans, sedan två 2-cm snitt från mittlinjen lateralt från vardera änden. Dra tillbaka och stift huden för att avslöja peritonealdialys och bröstkorg håligheter. Skär försiktigt genom den tunna genomskinliga membran som omger bukhinnan och återspeglar bröstkorgen att avslöja mediastinum.
- Hitta och ta bort 2-4 mediastinum lymfkörtlar, lite rygg-och sidled intill bräss, medialt intill brachiocephalic artär, nära den ventrala sidan av luftstrupen. Hitta och ta bort upp till sex noder kröslymfknutor, inbäddade i den mjuka vita mesenteriala vävnad som förankrar tarmarna till den bakre bukväggen. Hitta och ta bort mjälten, en lång, mörk röd orgel ligger strax lateralt om medellinjen och dorsala till tarmen på vänster sida av buken. Reserv lymfkörtlar i 1 ml RPMI 1640 medium på is tills dissekering är klar.
- Upplösta och tryck lymfkörtlar genom ett 40 ìm nät sil i 3 ml RPMI i en plast petriskål med kolven i en 1 ml spruta. Skölj sil med ytterligare 2 mL RPMI och överföra den 5 fjädring mL cell till ett 15 ml koniskt rör. Skölj petriskål med ytterligare 5 ml RPMI och transfer till samma rör. Centrifugera 5 minuter vid 250 xg, kassera supernatanten, återsuspendera cellen pelleten i 1 ml FACS buffert (1X PBS, 1% bovint serumalbumin och 10 mM EDTA) och överför till en 1,5 ml Eppendorf-rör.
Följande är en typisk färgningsprotokollet för att identifiera immunceller delmängder med fluorescerande antikroppar mot välkarakteriserad immunmarkörer cellytan. Alla antikroppar var utspädd i FACS buffert omedelbart före användning.
- Räkna celler och delmängd 10 6 celler i Eppendorf-rör. Centrifugera cellerna (se 2.7) och tvätta pellets 2X med 1 ml FACS buffert.
- Inkubera cellerna 20 min på is i 100 mikroliter på 2 ng / ml råtta anti-mus CD16/32 att blockera endogena Fc-receptorer. Pellets och celler tvätta med FACS buffert.
- Tillsätt 100 mikroliter av 1ng / ml lämplig fluorescerande antikroppar mot (er) till varje prov och inkubera på is i en timme. Tillsätt 100 mikroliter av FACS buffert ensam styra celler. Pellets och celler tvätta två gånger med FACS buffert.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml ACK buffert (150 mM NH 4 Cl, 1 mm KHCO 3 och 0,1 mM EDTA) Inkubera på is i 1 min för att lysera röda blodkroppar. Pellets och celler tvätta med FACS buffert. Återsuspendera cellerna i 1 ml FACS buffert.
- Samla in data från celler med hjälp av en flödescytometer som kan multicolor detektion och analys, normalt med 405, 488 och 633 lasrar nm excitation och 09:55 fluorescens detektorer utsläpp.
4. Representativa resultat:
Vi renade prion stavar från råolja, prion-infekterade hjärna homogenatet (figur 1) Tvättmedel lösningsgörande och ultracentrifugering av E2 älg hjärnan homogenatet (körfält 1 och 2) berikad kraftigt för prion stavar (jämför körfält 1 och 3), vilket också var proteas K resistenta (Lane 4). Intressant nog visade osmält renat prion stavar ett glycoform profil slående lik smälta E2 hjärnan homogenatet, visar dramatiska berikande för prioner. Identiskt behandlade hjärnans normala homogenatet gav inga PK-resistenta PrP C (körfält 5 och 6).
Flödescytometrisk analys av specifika cellpopulationer visa att antigenpresenterande celler hem till bukhinnan med två timmar och behålla fluorescerande pärlor och stavar prion, vilket framgår av ökat dramatiskt fluorescens över PBS injicerade kontroller (Figur 2). Inga celler skördats från bukhinnan PBS-behandlade kontroller visas fluorescens över bakgrunden (Fig. 2A-G), medan celler från pärla (bild 2H-N) och prion (bild 2O-U)-inokulerade möss visade betydande fluorescens, speciellt på monocyter (bild 2I och P), dendritiska celler (Fig. 2K och R) och makrofager (bild 2L och S), och vissa neutrofiler (Figur 2J och Q) och färre B-celler (Figur 2T). Bead och Prion bärande monocyter, dendritiska celler och makrofager hittades också i de mediastinala lymfkörtlarna två timmar efter inokulering (bild 2AD och AK, AF och AM och AG och AN, respektive), medan få eller inga PrP CWD-bärande Neutrofiler hade B eller T-celler som finns där (se diagram 2AE och AL, AH och AG och AI och AP, respektive). Vi upptäckte inga kulor eller stavar prion i mjälten eller kröslymfknutor (data visas inte). I sin helhet, dessa data visar att immunceller trafiken prioner mycket samma sätt som andra partiklar antigener.
| REAGENS | Fluorokrom | EXCITATION LASER (nm) | PEAK UTSLÄPP (nm) |
| Prion stavar | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 mikrometer pärlor | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| Antikroppar | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Fykoerytrin-Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R-Phycoerythrin | 488 | 575 |
| Fykoerytrin-Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R-Phycoerythrin | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin-Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R-Phycoerythrin | 488 | 575 |
Figur 1. Rening av prion stavar från infekterade hjärnan homogenatet. Vi använde en 10% homogenatet råa hjärnan från en CWD-smittade hjortar (E2, körfält 1 och 2) som utgångsmaterial som vi renade aggregerade prion stavar (körfält 3 och 4). Både rå och renad material visade karakteristiska resistens mot proteas K behandling (körfält 1 - 4), medan hjärnans normala homogenatet inte (körfält 5 och 6). Molekylvikt markörer visas i Kd till vänster om blot. BH, hjärna homogenatet.
Figur 2. Flödescytometrisk analys av immunceller människohandel prioner från bukhinnan till mediastinala lymfkörtlar två timmar efter ympningen. PBS (paneler AG och V-AB), var fluorescerande kulor (HN och AC-AI) eller stavar Prion (OU och AJ-AP) injiceras i bukhinnan på möss och celler skördas från peritoneal lavage (AU) eller mediastinala lymfkörtlar (V-AP) två timmar senare. Grafer i den första cellerna kolumnen visar från möss som behandlats med PBS (paneler A och V), fluorescerande kulor (panel H och AC) och stavar prion (paneler O och AJ). Fluorescerande celler (röda eller gröna prickar) och den totala celler (grå prickar) ritas upp för att visa den relativa storleken (Forward Scatter), granularitet (Side Scatter) och andel av de totala levande celler som fluorescerar. Betydande antal celler karaktäristiska av granulocyter kvar fluorescerande pärlor och stavar. Cellerna har också färgats med antikroppar mot immunmarkörer cellytan och gated för LyG-Ly6C + monocyter (paneler B, I, P, W, AD och AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrofiler (C, J, Q, X, AE och AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + dendritiska celler (D, K, R, Y, AF och AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + makrofager, (E, L, S, Z, AG och AN), CD3 -B220 + CD21 + B-celler (F, M, T, AA, AH och AO) och CD21-B220-CD3 + T-celler (G, N, U, AB, AI och AP). Monocyter, dendritiska celler och makrofager behållit fluorescerande pärlor och stavar prioner i bukhålan (paneler I och P, K och R och L och S, respektive) och transporterade dem till mediastinala lymfkörtlar (paneler AD och AK, AF och AM och AG och AN, respektive), visar liknande upptag av och handel med dessa två partiklar. Neutrofiler behållit en betydande mängd pärlor (J) och färre stavar (Q), men misslyckades med att leverera dem till lymfkörtlarna (AE och AL). B-celler kvar och transporteras några stavar (T och AO), men nästan inga kulor (M och AH). T-celler trafikerade varken kulor eller stavar (N, U, AI och AP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi ett protokoll för märkning och spårning av prioner in vivo som avsevärt underlättar övervakning tidigt händelser i perifera prion infektion. Detta protokoll förbättrar i hög grad på tidigare försök till att övervaka prion upptag in vitro 9 och in vivo 3,12 genom att pre-märkning höganrikat prioner inokulat att entydigt skilja den från endogen PrP C. Eftersom smittsamma prioner och PrP C delar samma primära aminosyrasekvensen har genererar prion-specifika antikroppar varit problematisk. Vi har utfört liknande experiment med PrP null möss injiceras med PK smält-och metanol fälls råa hjärnan homogenatet att vi spåras med hjälp Dylight 649-labelelled anti-PRP-antikroppar (vårt opublicerade data). Dessa experiment produceras nästan identiska resultat som visas här, men PrP null möss inte är kommersiellt tillgängliga, inte är mottaglig för prionsjukdom 19 och saknar den enda äkta prion receptorn kända, PrP C. Detta protokoll möjliggör användning av gemensamma stammar laboratorium möss som uttrycker endogena PrP C, undanröja eventuella problem med hjälp av PrP null möss.
De data som visas här visar att immunceller fånga och prioner trafik och fluorescerande kulor lika, men B-celler har identifierats som människohandel den förra men inte det senare. Detta bekräftar tidigare studier binder B-celler som prion människohandlare 6. Dock innehåller vår höganrikat prion förberedelse sannolikt små mängder av ytterligare märkta proteiner, så vi kan inte utesluta att immunceller trafik dessa proteiner också. Oavsett om mycket små mängder kontaminerande protein ändra prion människohandel eller efterliknar den verkliga biologiska scenariot återstår att fastställa.
Lyckad övervakning av immunceller människohandel två olika partiklar föreslår vidare att detta protokoll kan anpassas till en mängd olika antigener som kan märkas och spåras, såsom parasiter, bakterier, virus och proteiner.
När du utför ultracentrifugering steg i detta protokoll, kan stora provvolymer vara alikvoteras till mindre för bekväm centrifugering så länge nyckeltal förblir konstant. Till exempel, istället för att skiktning 100 ml av provet över 900 ml sackaros, man kan lager 10 ml under 90 ml i separata rör, centrifugera sedan.
Höjning musen posteriort under vaccinationer flyttar peritoneal organ anteriorly, minimera oavsiktlig nålskada till dem. Sakta och försiktigt sätta nålar när inokulering möss och injicera och aspirering PBS från bukhinnan för att undvika att sprängas sönder denna känsliga membran.
När dissekera möss, vara noga med att skära endast om huden i den inledande snitt lämnar tunt membran som täcker bukhinnan och mediastinum intakt, för att undvika att skära blodkärl och organ som kan störa lymfkörtel identifiering och inhämtning.
Lymfkörtlar kan vara svårt att identifiera en början, ofta ser ut som fettvävnad. Lymfkörtlar verkar nästan rund, benvita till krämfärgade och fastare än fettvävnad. Dessa blir mycket lättare att identifiera sig med praktiken. Pool lymfkörtlar från minst två möss att återhämta sig tillräckligt med celler för flödescytometrisk analyser.
För samtidigt identifiera flera markörer cellytan, rekommenderar vi starkt med fluorescerande antikroppar över omärkta antikroppar som kräver en sekundär fluorescerande anti-isotyp antikropp för detektion, eftersom de senare experimentell design kräver noggrant urval av antikroppar som genereras från flera olika arter och många fler kompletterande prover kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Steve McBryant och Jeff Hansen för hjälp med ultracentrifugering och Patti Kiser för hjälp med mus hantering. Det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke vid National Institutes of Health, bevilja 5R01NS056379-02 finansierade detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
