Summary
लारवल zebrafish पहली हड्डीवाला मॉडल के लिए एक रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन और लक्ष्य कंकाल की मांसपेशी से एक साथ पैच दबाना रिकॉर्डिंग की अनुमति प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह वीडियो सूक्ष्म कमानी एक मोटर न्यूरॉन कैप और लक्ष्य मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका प्रकार से रिकॉर्डिंग के लिए तरीके की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों को दर्शाता है.
Abstract
लारवल zebrafish पहली हड्डीवाला मॉडल के लिए एक रीढ़ की हड्डी में पेशी मोटर न्यूरॉन और लक्ष्य से एक साथ पैच दबाना रिकॉर्डिंग की अनुमति प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह दोनों प्रकार की कोशिकाओं और नेत्रहीन आकारिकी और स्थान के आधार पर एकल कमानी मोटर न्यूरॉन कैप भेद करने की क्षमता के लिए पहुंच का एक सीधा परिणाम है. इस वीडियो के लिए एक टोपी मोटर न्यूरॉन और लक्ष्य मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रत्येक कोशिका प्रकार से रिकॉर्डिंग के लिए तरीके की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता सूक्ष्म तरीकों को दर्शाता है. कैप प्रकार मोटर न्यूरॉन की पहचान या तो डाई भरने के द्वारा या जैसे संभावित कार्रवाई तरंग और सेल इनपुट प्रतिरोध biophysical सुविधाओं द्वारा की पुष्टि की है. मोटर न्यूरॉन रिकॉर्डिंग नियमित रूप से एक घंटे के कई अलग अलग लक्ष्य मांसपेशियों की कोशिकाओं से लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग की अनुमति देने के लिए पिछले. मोटर न्यूरॉन फायरिंग पैटर्न पर नियंत्रण neuromuscular जंक्शन पर synaptic संचरण की आवृत्ति निर्भरता के माप सक्षम बनाता है. एक बड़े quantal आकार और कम शोर पूरे सेल वोल्टेज दबाना द्वारा प्रदान की एकात्मक घटनाओं के कारण, सभी मांसपेशियों में सुलझाया जा सकता है. यह सुविधा रिलीज गुण, पुटिका रीसाइक्लिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से synaptic अवसाद और सरलीकरण जैसे बुनियादी synaptic गुणों का अध्ययन परमिट. vivo तैयारी ग्रहण पिछले neuromuscular मॉडल प्रणाली में इस के द्वारा की पेशकश फायदे जिसमें मोटर न्यूरॉन्स आमतौर पर बाह्य इलेक्ट्रोड के द्वारा प्रेरित कर रहे हैं का अध्ययन किया और मांसपेशियों को पूरे सेल पैच दबाना के लिए बहुत बड़ी हैं. zebrafish तैयारी ट्रांसजेनिक लाइनों, morpholino पछाड़ना, औषधीय हस्तक्षेप और vivo इमेजिंग में सहित दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ electrophysiological विश्लेषण के संयोजन के लिए उत्तरदायी है. इन तरीकों, neuromuscular रोग zebrafish के उत्परिवर्ती लाइनों द्वारा प्रदान की मॉडल की बढ़ती संख्या के साथ युग्मित, मानव neuromuscular विकारों की नई समझ के लिए दरवाजा खुला है.
Protocol
1. मछली की बनती रिकॉर्डिंग के लिए तैयार
- प्रक्रिया की शुरुआत से पहले, पाँच प्रमुख समाधान है, जो शामिल तैयार: स्नान समाधान, (MS222) Tricaine, Formamide, न्यूरॉन आंतरिक समाधान और बलवान आंतरिक समाधान के साथ स्नान समाधान के साथ स्नान समाधान.
- अगला, 72 से 96 घंटे की उम्र और Tricaine साथ स्नान समाधान में जगह के बीच एक एकल लार्वा zebrafish इकट्ठा. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए जोखिम के एक मिनट के भीतर, मछली स्पर्श जवाब नहीं होगा.
- एक प्लास्टिक पकवान के शीर्ष पर मछली प्लेस और एक stereomicroscope का उपयोग करने के लिए, एक डबल बढ़त रेजर ब्लेड के साथ सिर काटना.
- एक गिलास रिकॉर्डिंग sylgard के साथ लेपित और स्नान समाधान से भरा कक्ष में मछली स्थानांतरण. Notochord के माध्यम से electrolytically तेज टंगस्टन पिन डालने से प्रत्येक के अंत में जकड़ना.
- बनाएँ एक पिन है कि ठीक संदंश की एक जोड़ी के लिए पर्याप्त पकड़ प्रदान करेगा के साथ मछली के व्याख्यान चबूतरे वाला अंत के पास एक त्वचा प्रालंब. व्याख्यान चबूतरे वाला पिन के पास यह ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ मनोरंजक overlying त्वचा निकालें. दुम दिशा में धीरे - धीरे पील त्वचा को हटाने के लिए.
- 3-5 करने के लिए मांसपेशी संकुचन है कि रिकॉर्डिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है ब्लॉक मिनट के लिए Formamide के साथ स्नान समाधान के 3 mls के साथ मछली समझो. सामान्य स्नान समाधान के साथ 5 बार धोएं. धीरे एक टंगस्टन पिन के पक्ष के साथ समाप्त द्वारा 5 से 6 खंडों से अधिक मांसपेशियों की सतही परत का हिस्सा निकालें.
- एक ईमानदार एक फैराडे पिंजरे में स्थित बिजली के शोर ढाल खुर्दबीन मछली स्थानांतरण. खुर्दबीन एक निश्चित मंच के साथ सुसज्जित है, लंबे समय से दूरी 40x उद्देश्य और 0.5 का ज़ूम 4x करने के लिए काम कर रहा है. खुर्दबीन एक motorized XY अनुवाद चरण पर मुहिम शुरू की है क्रम में करने के लिए और उच्च शक्ति के तहत तंत्रिका और मांसपेशियों के बीच तैयार चाल. अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग करने के लिए न्यूरॉन्स कल्पना में मदद करता है.
- 0.5 एक्स ज़ूम के तहत, एक विस्तृत 15 माइक्रोन बोर विंदुक उपयोग overlying मांसपेशियों को हटाने और रीढ़ की हड्डी को बेनकाब. नकारात्मक दबाव एक 3 सीसी डिस्पोजेबल सिरिंज और मांसपेशियों की कोशिकाओं के माध्यम से लागू किया जाता है एक एक करके हटा दिया. कंकाल की मांसपेशी के 5 से 6 पृष्ठीय क्षेत्रों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराया है. एक ही व्यापक बोर विंदुक भी उदर मांसपेशी की ऊपरी दो परतों को हटाने के लिए लक्ष्य तेजी से कंकाल की मांसपेशी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- यह बनती रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी पूर्ण और माइक्रोस्कोप ज़ूम 1.6x लगभग वृद्धि हुई है.
2. मोटर न्यूरॉन कैप की बनती रिकॉर्डिंग और लक्ष्य की मांसपेशी कोशिकाओं
- साफ क्षेत्रों कैप न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए स्कैन कर रहे हैं. प्रत्येक रीढ़ की हड्डी के Hemi - खंड एक बड़ी, 10 माइक्रोन व्यास, कैप मोटर न्यूरॉन शामिल हैं. यह अश्रु आकार सोम अल्पज्ञता रीढ़ की हड्डी dura के तहत कमानी सीमा की दुम का सबसे अंत के पास स्थित है. एक कैप न्यूरॉन रिकॉर्डिंग के लिए चुना है और आसन्न दुम खंड में उदर लक्ष्य मांसपेशियों अखंडता की जाँच करने के लिए स्कैन है.
- दो पैच इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, एक न्यूरॉन के लिए और मांसपेशियों के लिए एक दूसरे के लिए तैनात हैं. ऊपरी इलेक्ट्रोड कठिन रीढ़ की हड्डी dura और लगभग 2 microns के टिप खोलने के प्रवेश के लिए एक उथले घटना है. कम इलेक्ट्रोड कंकाल की मांसपेशी के कम प्रतिरोध वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक steeper शंकु
- लगभग 30 डिग्री करने के लिए रीढ़ की हड्डी dura घुसना का एक कोण पर स्थिति न्यूरॉन इलेक्ट्रोड, के बारे में एक आधा चयनित कैप न्यूरॉन के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला खंड. एक अक्षीय ड्राइव जोड़तोड़ का उपयोग करते हुए एक सज्जन लगभग 60 मिलीमीटर पारा के निरंतर सकारात्मक दबाव लागू इलेक्ट्रोड अग्रिम. Dura के रूप में इलेक्ट्रोड के माध्यम से टूट जाता है, कैप न्यूरॉन इलेक्ट्रोड से छिड़काव द्वारा विस्थापित किया जा सकता है, ध्यान की एक पुनः समायोजन की आवश्यकता होती है.
- जब इलेक्ट्रोड छू कैप न्यूरॉन सोम सकारात्मक दबाव जारी है और आमतौर पर एक gigaohm सील की तत्काल गठन में परिणाम. हालांकि, कुछ मामलों में जहां एक मुहर फार्म करने के लिए विफल रहता है, यह एक कोमल नकारात्मक दबाव लागू करने के लिए आवश्यक हो जाता है. सील गठन के बाद, इलेक्ट्रोड क्षमता से - 80mV निकाला जाता है और नकारात्मक दबाव के आवेदन के कोशिका झिल्ली ruptures. कैप न्यूरॉन 140 से 180 मेगा-ohms के एक इनपुट प्रतिरोध और एक कार्रवाई संभावित है कि overshoots 40 millivolts के द्वारा विशेषता है. यह संवर्द्धित वर्तमान दबाना तहत depolarizing कदम बढ़ाने तक संभावित कार्रवाई हासिल है इंजेक्शन द्वारा परीक्षण किया है.
- अगला, माइक्रोस्कोप वेंट्रल उच्च शक्ति के तहत XY motorized अनुवादक का उपयोग मांसपेशियों को दूसरी जगह है. एक तेजी से मांसपेशी कोशिका लक्ष्य क्षेत्र से चुना जाता है.
- मांसपेशियों इलेक्ट्रोड सकारात्मक दबाव के तहत लक्ष्य मांसपेशी कोशिका है, जो जब जारी की, एक gigaohm मुहर रूपों की ओर उन्नत है. इलेक्ट्रोड संभावित -50 millivolts के लिए निकाला जाता है सोडियम चैनल निष्क्रिय और कोमल चूसना तहत कोशिका झिल्ली उठी है. 100 करने के लिए 200 मेगा - ओम प्रतिरोध और बड़े capacitive यात्रियों संकेतों प्रविष्टि के अचानक उपस्थिति में एक बूंद.
- परीक्षण करने के लिएबनती रिकॉर्डिंग के लिए, वर्तमान के संवर्द्धित बड़ा इंजेक्शन द्वारा मोटर न्यूरॉन depolarized है जब तक एक संभावित कार्रवाई हासिल है. इस बिंदु पर एक endplate वर्तमान मांसपेशियों में हासिल किया जाना चाहिए. Motorneuron की विफलता के बिना endplate धाराओं में 1 हर्ट्ज परिणामों पर जारी उत्तेजना. के रूप में उत्तेजना आवृत्ति 100 हर्ट्ज के लिए बढ़ जाती है endplate धाराओं आयाम में उतार चढ़ाव और उत्तेजना के 10 सेकंड के भीतर कार्यात्मक रिक्तीकरण से गुजरना.
3. प्रतिनिधि परिणाम
आमतौर पर, न्यूरॉन रिकॉर्डिंग एक घंटे के लिए स्थिर है, लेकिन मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में श्रृंखला प्रतिरोध में वृद्धि के रूप में परिलक्षित खराब है. जब ऐसा होता है प्रयोग या समाप्त होता है एक और मांसपेशी कोशिका है पैच clamped. सभी रिकॉर्डिंग के एक घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए है.
चित्रा 1 motorneuron कार्रवाई (एपी, ऊपर) क्षमता और जुड़े मांसपेशी वर्तमान endplate (ईपीसी, नीचे) की रिकॉर्डिंग. एक कैप न्यूरॉन के लिए संभावित कार्रवाई overshoot 40 mV और ईपीसी एक मिसे 1 के तहत लगातार समय के साथ एक घातीय समय पाठ्यक्रम के साथ 300 μsec और क्षय के भीतर चाहिए वृद्धि चाहिए.
| नाम | विधि |
| स्नान समाधान (मिमी में) | NaCl 134, KCl 2.9, 2.1 2 CaCl, 1.2 MgCl 2, 10 ग्लूकोज, ना - HEPES 10, 7.8 पीएच |
| Tricaine साथ स्नान समाधान | स्नान समाधान युक्त 0.02% tricaine |
| Formamide साथ स्नान समाधान | स्नान 2M formamide युक्त समाधान |
| न्यूरॉन आंतरिक समाधान (मिमी में) | 115 कश्मीर gluconate, 15 KCl, 2 2 MgCl, 10 K-HEPES, 5 कश्मीर EGTA, 4 मिलीग्राम एटीपी, 7.2 पीएच |
| बलवान आंतरिक समाधान (मिमी में) | KCl 120, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, 7.4 पीएच |
तालिका 1 समाधान.
Discussion
हम zebrafish बनती रिकॉर्डिंग (वेन और Brehm, 2005) उच्च आवृत्ति उत्तेजना के दौरान मुख्य पुटिका रिलीज और रीसाइक्लिंग की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है. इस प्रक्रिया गतिशीलता सामान्य synaptic प्रसारण जिसमें म्यूटेंट में बाधित है कुंजी synaptic घटकों में बिंदु उत्परिवर्तन के कारण समझौता है. उदाहरण के लिए, म्यूटेशनों कि postsynaptic रिसेप्टर (ओनो एट अल, 2001, 2002, 2004) समुच्चय और presynaptic ट्रांसमीटर के संश्लेषण (वैंग एट अल., 2008) संयुक्त राष्ट्र के समन्वित तैराकी में परिणाम बाधित. बनती रिकॉर्डिंग जानकारी है कि कार्यात्मक दोष के स्रोत तुच्छ कर सकते हैं, इस तरह व्यवहार, आनुवांशिकी, और शरीर विज्ञान जोड़ने प्रदान करते हैं. अब यह संभव हो सकता है आगे क्षणिक अभिव्यक्ति के माध्यम से कैप विवेकपूर्ण प्रमोटरों का उपयोग मोटर न्यूरॉन्स में synaptic प्रसारण अंतर्निहित प्रक्रियाओं काटना चाहिए. इस तरह प्रमुख नकारात्मक या उत्परिवर्तित जीन विशेष रूप से इन न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जा सकता है और दोनों व्यवहार और electrophysiological परिणाम को निर्धारित है. अतिरिक्त पूरे सेल विन्यास द्वारा की पेशकश लाभ एजेंटों के साथ टोपी सोम डायलिसिस कि संभवतः पुटिका रीसाइक्लिंग, clostridial विषाक्त पदार्थों और कैल्शियम buffers के रूप में बदल सकते हैं अनुमति देता है. सोम और मांसपेशियों के बीच छोटी दूरी के कारण, प्रसार अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग के समय सीमा के भीतर हो जाना चाहिए. इस तैयारी की क्षमता केवल दोहन होना शुरू हो गया है. synapses के इस युग और सतही स्थान पर मछली की पारदर्शिता भी ऑप्टिकल उपकरणों के उपयोग की सुविधा है (; Fetcho और Higashijima, 2004 Fetcho और O'Malley, 1997). हम बहुत सफल रहने वाले एफएम रंग और Synaptophluorin (ली एट अल., 2003) के रूप में आनुवंशिक संकेतकों का उपयोग कर मछली में एंडो exocytosis के मापने में किया गया है . इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट संयुग्मित विषाक्त पदार्थों को जीवित मछली (Ibanez Tallon एट अल., 2004) के इमेजिंग के लिए synaptic प्रोटीन लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तैयारी की सादगी को देखते हुए यह भविष्य के अध्ययन के लिए महान वादा धारण.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एनआईएच (एन एस - 18,205) वित्त पोषित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
