Kopplade Patch Clamp Inspelningar från Motor-neuron och Target skelettmuskulaturen i Zebrafish

Summary

Larver zebrafisk representerar det första systemet ryggradsdjur modell för att möjliggöra samtidig inspelning patch clamp från en spinal motor-neuron och mål skelettmuskulaturen. Denna video visar den mikroskopiska metoder som används för att identifiera en segmentell Cap motor-neuron och mål muskelceller samt metoder för inspelning från varje celltyp.

Abstract

Larver zebrafisk representerar det första systemet ryggradsdjur modell för att möjliggöra samtidig inspelning patch clamp från en spinal motor-neuron och utvalda muskeln. Detta är en direkt följd av tillgängligheten till både celltyper och förmåga att visuellt urskilja enskild segmentell Cap motor-neuron på basis av morfologi och plats. Denna video visar den mikroskopiska metoder som används för att identifiera en Cap motor-neuron och mål muskelceller samt metoder för inspelning från varje celltyp. Identifikation av den gemensamma jordbrukspolitiken motor-neuron typ bekräftas av antingen färgämne fyllning eller av biofysiska funktioner som aktionspotentialens vågform och cell-ingång motstånd. Motor-neuron inspelningar rutinmässigt pågå i en timme tillåter långa inspelningar från flera olika celler utvalda muskeln. Kontroll över motor-neuron bränning mönster möjliggör mätningar av frekvens-beroende av synaptiska transmissionen i den neuromuskulära förbindelsen. På grund av ett stort quantal storlek och låg ljudnivå från hela cellspänning klämma, kan alla av den administrativa händelser lösas i muskeln. Denna funktion medger studie av grundläggande synaptiska egenskaper såsom frisättning, vesikler återvinning samt synaptisk depression och underlättande. Fördelarna med detta in vivo förberedelse solförmörkelse tidigare neuromuskulära modellsystem studeras där motor-nervceller är ofta stimuleras av extracellulära elektroder och musklerna är för stora för hela cell patch clamp. Den zebrafisk Beredningen är mottaglig att kombinera elektrofysiologiska analys med ett brett spektrum av metoder, bland annat transgena linjer, morpholino ÖVERVÄLDIGANDE, farmakologisk behandling och in vivo imaging. Dessa metoder, tillsammans med det växande antalet neuromuskulär sjukdom modeller som muterade rader av zebrafisk, öppna dörren för ny förståelse av människans neuromuskulära sjukdomar.

Protocol

1. Beredning av fisk för Kopplade Recordings

1. Innan du påbörjar proceduren, förbereda fem viktiga lösningar som inkluderar: Bath Solution, Bad Lösning med Tricaine (MS222), Bad Lösning med formamid, Neuron intern lösning och Muscle intern lösning.
2. Därefter samlar en enda larv zebrafisk i åldrarna 72 till 96 timmar och placera i Bath Lösning med Tricaine. Inom en minut efter exponering för bedövning, kommer fisken inte svara på beröring.
3. Placera fisken på toppen av en plast skålen och, med hjälp av ett stereomikroskop, halshugga med en dubbel kant rakblad.
4. Överför fisk till ett glas inspelning kammare täckt med sylgard och fylld med bad Solution. Fäst i varje ände genom att föra in elektrolytiskt vässade volfram stift genom notochord.
5. Skapa en hud flik nära rostralt slutet av fisk med ett stift som kommer att ge en adekvat grepp för ett par fina tång. Ta bort den överliggande huden genom att ta tag den nära rostralt stift med ett par fina tång. Skala långsamt i caudal riktning att ta bort huden.
6. Behandla fisken med 3 ml av Bath Lösning med formamid i 3-5 minuter för att blockera muskelsammandragningar som kan störa inspelningar. Tvätta 5 gånger med normal Bath Solution. Ta del av det ytliga lagret av muskler över 5 till 6 segment genom att försiktigt skrotning med sidan av en volfram stift.
7. Överför fisken till upprätt mikroskop ligger i en Faradays bur för att skydda elektriska störningar. Mikroskopet är utrustat med en fast fas, långa arbetsdagar avstånd 40x objektiv och zoom på 0,5 till 4x. Mikroskopet är monterad på en motordriven XY översättning stadium för att flytta preparatet mellan nerv och muskel under hög effekt. Användning av kontrastmedel differential interferens optik hjälper till att visualisera nervceller.
8. Under 0,5 x zoom, använda ett brett födde 15-micron pipett för att ta bort överliggande muskler och utsätta ryggmärgen. Undertryck appliceras via en 3 cc engångsspruta och muskelceller tas bort en efter en. Denna procedur upprepas för 5 till 6 rygg delar av skelettmuskulaturen. Samma breda bar pipett används för att också ta bort de övre två lager ventrala muskler för att få rikta snabbt skelettmuskulaturen.
9. Detta avslutar förberedelserna för parade inspelningar och mikroskopet zoom ökas till ca 1,6 x.

2. Kopplade Inspelningar från Cap Motor-neuron och Target muskelceller

1. De rengjorda segmenten scannas att hitta gemensamma jordbrukspolitiken nervceller. Varje hemi-segment av ryggmärgen innehåller en stor, 10 micron diameter, Cap motor-neuron. Detta teardrop formade Soma ligger ytligt under spinal dura nära caudal mest slutet av segmentell gränsen. En Cap neuron väljs för inspelning och den ventrala utvalda muskeln i det angränsande caudal segmentet skannas för att kontrollera integriteten.
2. Två plåster elektroder är placerade för inspelning, en för neuron och en andra för muskel. Den övre elektroden har ett grunt kona för penetration av den tuffa spinal dura och dricks öppning på ca 2 mikrometer. Den nedre elektroden har en brantare kona för låg resistans spänning klämma inspelning av skelettmuskulatur
3. Placera neuron elektroden i en vinkel på ungefär 30 grader för att tränga in i spinal duran, ungefär en halv etapper rostralt till den valda Cap neuron. Advance elektroden med hjälp av en axial drive manipulator samtidigt som en lätt kontinuerligt övertryck på cirka 60 millimeter kvicksilver. Som elektroden bryter igenom duran, kan den gemensamma jordbrukspolitiken neuron förskjutas av perfusion från elektroden, vilket kräver en justering av fokus.
4. När elektroden rör den gemensamma jordbrukspolitiken neuron Soma övertryck släpps och oftast resulterar i omedelbar bildandet av en gigaohm säl. Men i vissa fall där en tätning inte form, blir det nödvändigt att tillämpa en lätt undertryck. Efter tätning formation Elektroden är potentiella anpassas till-80mV och tillämpning av undertryck bristningar cellmembranet. Den gemensamma jordbrukspolitiken neuron är karakteriseras av en insats motstånd på 140 till 180 mega-ohm och en aktionspotential som skjuter 40 millivolt. Detta testas genom att injicera stegvis öka depolariserande stegen under strömtång tills aktionspotential utlöses.
5. Därefter är det mikroskop flyttas till ventrala muskler med XY-motoriserade översättaren under hög effekt. En snabb muskelcellen väljs från målet fältet.
6. Muskeln elektroden är avancerade mot målet muskelcellen med övertryck, som när det släpps, bildar en gigaohm tätning. Elektroden potentiella anpassas till -50 millivolt att inaktivera natriumkanaler och under milda suger cellmembranet är spruckit. En droppe i motståndet mot 100 till 200 mega-ohm och det plötsliga uppdykandet av den stora kapacitiva transienter signaler inträde.
7. För att testaför parade inspelning är motor-neuron depolarized av stegvis större injektioner av ström tills en aktionspotential utlöses. Vid det här laget en gavel aktuell bör uppnås hos muskeln. Fortsatt stimulans av motorneuron frekvens på 1 Hz resulterar i ändplattan strömmar utan fel. Som stimulans frekvensen ökas till 100 Hertz ändplattan strömmarna varierar i amplitud och genomgår funktionell utarmning inom 10 sekunder efter stimulering.

3. Representativa resultat

Normalt är neuron inspelningen stabil i upp till en timme men muskelcellerna försämras vilket återspeglas som en ökning i serien motstånd. När detta inträffar experimentet är antingen upp eller annan muskel cell patch fastklämd. Alla inspelningar bör vara avslutad inom en timme.

Figur 1. Inspelningar av motorneuron aktionspotentialens (AP, överst) och tillhörande muskler ändplattan ström (EPC, botten). Aktionspotentialens ett tak neuron bör överskridande 40 mV och EPC bör öka inom 300 μsec och förfall längs en exponentiell tid kurs med en tidskonstant under 1 millisekund.

Namn	Recept
Bad Solution (i mm)	134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 2 MgCl, 10 glukos, 10 Na-HEPES, pH 7,8
Bad Lösning med Tricaine	Bath Lösning innehållande 0,02% tricaine
Bad Lösning med formamid	Bath Lösning innehållande 2M formamid
Neuron intern lösning (i mm)	115 K-glukonat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 mg-ATP, pH 7,2
Muscle intern lösning (i mm)	120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4

Tabell 1. Solutions.

Discussion

Vi har använt sebrafisk parade inspelningar (Wen och Brehm, 2005) främst för att studera de processer av vesikler utsläpp och återvinning vid högfrekvent stimulering. Denna process avbryts i motilitet mutanter där normal synaptisk transmission är nedsatt på grund av punktmutationer i viktiga synaptisk komponenter. Till exempel, mutationer som stör postsynaptiska receptorn aggregat (Ono et al., 2001, 2002, 2004) och syntes av presynaptiska sändare (Wang et al., 2008) resultera i FN-samordnade simning. Kopplade inspelningar lämna de uppgifter som kan lokalisera källan till den funktionella fel, och därmed knyta beteende, genetik och fysiologi. Det bör nu vara möjligt att ytterligare dissekera de processer som ligger bakom synaptisk överföring med hjälp av övergående uttryck i den gemensamma jordbrukspolitiken motor-nervceller med hjälp av kloka initiativtagare. På detta sätt dominerande negativa eller muterade gener specifikt kan uttryckas i dessa nervceller och både beteende-och elektrofysiologiska effekter fastställas. Den ytterligare fördel som erbjuds av hela cellen konfiguration tillåter dialys av den gemensamma jordbrukspolitiken Soma med medel som potentiellt kan förändra vesikler återvinning, exempelvis clostridier gifter och buffertar kalcium. På grund av det korta avståndet mellan soma och muskler, bör spridningen ske såväl inom tidsramen av inspelningar. Potentialen för detta preparat har bara börjat utnyttjas. Öppenheten i fisken i denna ålder och ytliga placering av synapser underlättar också användningen av optiska hjälpmedel (Fetcho och O'Malley, 1997; Fetcho och Higashijima, 2004). Vi har varit mycket framgångsrika med att mäta av endo-och exocytos i levande fisk med hjälp av FM-färger och genetiska indikatorer såsom Synaptophluorin (Li et al., 2003). Dessutom kan fluorescerande konjugerade toxiner skall användas vid märkning synaptiska proteiner för avbildning av levande fisk (Ibanez-Tallon et al., 2004). Med tanke på enkelheten i denna beredning det är mycket lovande för framtida studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pneumatic transducer tester	Fluke Biomedical	DPM1B
0.002 x 3 inch tungsten rod	A-M Systems	715000
Sylgard 184 Elastomer	Dow Corning		The thickness of application will affect the DIC optics