Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Summary

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie die aktive DTH in Lewis-Ratten induzieren und Überwachung der entzündlichen Reaktion.

Abstract

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten, dass der Injektionsstelle eines Antigens, gegen die das Immunsystem grundiert hat infiltrieren vermittelt. Die Entzündungsreaktion wird durch Rötung und Schwellung der Website von antigenen Herausforderung geprägt. Es ist eine bequeme Modell, um die in vivo Wirksamkeit von Immunsuppressiva zu bestimmen. Kutane DTH kann entweder durch adoptiven Transfer von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten oder durch aktive Immunisierung mit einem Antigen, und die anschließende intradermal Herausforderung mit dem Antigen auf die entzündliche Reaktion in einem bestimmten Hautareal hervorrufen induziert werden. DTH-Reaktionen können auf verschiedene Antigene hervorgerufen werden, z. B. Ovalbumin, Tuberkulin-, Tetanus-Toxoid oder Napfschnecken-Hämocyanin (KLH).

Hier zeigen wir, wie eine aktive DTH-Reaktion in Lewis-Ratten zu induzieren. Wir werden zunächst ein Wasser-in-Öl-Emulsion von KLH, unser Antigen von Interesse, in komplettem Freund-Adjuvans und injizieren diese Emulsion subkutan bei Ratten. Dies wird prime das Immunsystem zu Gedächtnis-T-Zellen gerichtet an KLH zu entwickeln. Sieben Tage später werden wir die Ratten intradermal Herausforderung auf der Rückseite mit KLH auf der einen Seite und mit Ovalbumin, ein irrelevantes Antigen, auf der anderen Seite. Die entzündliche Reaktion sichtbar sein wird 16-72 Stunden später und die rot und geschwollen Bereich wird als Indiz für DTH Schwere gemessen werden.

Protocol

1. Herstellung der Emulsion

1. Die Emulsion ist eine 1:1-Mischung von Antigen (DTH kann auf verschiedene Antigene induziert werden: Ovalbumin, fügte Tetanustoxoid, Napfschnecken-Hämocyanin ....) in wässriger Lösung, um Freund-Adjuvans abzuschließen. Es ist sehr wichtig, um das Antigen an das Adjuvans und nicht umgekehrt hinzuzufügen!
   
   
2. Es gibt eine Menge von Abfällen, wenn Herstellung und Injektion einer Emulsion, so dass immer vorbereiten 1,5 oder 2-mal mehr als das, was Sie brauchen.
   
   
3. Lösen Sie Antigen in Kochsalzlösung zu einer 2 mg / ml Lösung herzustellen. Nicht filtern, weil Sie nicht möchten, dass die Aggregate locker!
   
   
4. Put komplettem Freund-Adjuvans H37Ra (Difco, Katalog # 231131) in einer Röhre und Wirbel mit hoher Geschwindigkeit. Fügen Sie die Antigen tropfenweise unter Vortexen. Wenn alle das Antigen zugesetzt wird, Wirbel für weitere 5 Minuten. Die Mischung sollte sich weiß.
   
   
5. Legen Sie die Emulsion in eine Glasspritze und verknüpfen es mit einem anderen Glasspritze mit einer 18G-Brücke (Fisher Katalog # 14-825-17L). Senden Sie die Emulsion aus einer Spritze auf der anderen, bis sie hart (5-10 min) wird. Am besten ist es, zwei 5 ml Spritzen verwenden. Wenn mehr als 5 ml Emulsion benötigt werden, verwenden Sie mehrere Sätze von 5 ml Spritzen.
   
   
6. Die Emulsion kann in die Spritzen bei 4 ° C für 3 Wochen gelagert.

2. Die Immunisierung der Ratten

1. Mix der Emulsion in die Spritzen für ein paar Minuten und Transfer zum Spritzen für die Injektion verwendet. Inject 200 ml subkutan in 1-2 Seiten an der Basis des Schwanzes mit 23G Nadeln und ein Luer-Lok Spitze 3 ml Spritze.

3. Challenge mit Antigen in den Rücken

1. Sieben Tage nach der Immunisierung, rasieren 2 Spots auf dem Rücken der Ratten und injizieren intradermal 20 ml einer 1 mg / ml Antigen-Lösung auf einem Fleck und Kochsalzlösung (oder irrelevant Antigen) in den anderen Ort. Nicht filtern die Antigen-Lösung, wie man Aggregate, die die Entzündungsreaktion verstärken können locker.
   
   
2. Die Ratten sollten narkotisiert, um Bewegungen zu vermeiden. Injizieren Sie die Lösung intradermal mit 27G ½ Nadeln und 1 ml Spritzen. Ändern Nadeln zwischen den Injektionen.
   
   Hinweis: Die Herausforderung in der Ohrmuschel der Ohren statt an der Rückseite für genauere Messungen durchgeführt werden. Siehe Video bei http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Messung von DTH

1. Die Einstichstelle beginnt Rötung und Schwellung als Zeichen der Entzündung. Messen Sie den Durchmesser des entzündeten Bereich mit einem Lineal oder noch besser, haben eine Dicke. Die maximale Schwellung sollte zwischen 24 und 72 Stunden auftreten.

Discussion

Für eine genauere Messung der DTH-Reaktion empfehlen wir gegen die Ratten, die mit dem Antigen in der Ohrmuschel. Die Reaktion kann dann als Differenz in Ohrschwellung zwischen den relevanten Antigen-herausgefordert Ohr und das Ohr entweder mit Kochsalzlösung alleine oder mit dem irrelevanten Antigen herausgefordert gemessen werden. Eine Demonstration der Herausforderung im Ohr ist in 1 dargestellt.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.