Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Summary

Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att dissekera, transfektera via elektroporation och kultur mus hippocampus och kortikala neuron. Kortfristiga kulturer kan användas för studier av axon utväxt och vägledning, medan de långa kulturer kan användas för studier av synaptogenesis och dendritiska ryggraden analys.

Abstract

Hippocampus och kortikala neuron har använts i stor utsträckning för att studera det centrala nervsystemet (CNS) neuronala polarisation, axonet / Dendrite utväxt och synaps bildning och funktion. En fördel med odling av dessa nervceller är att de lätt polarisera och bildar distinkta axoner och dendriter, på en tvådimensionell substrat vid mycket låga tätheter. Denna egenskap har gjort dem mycket användbara för att bestämma många aspekter av nervsystemets utveckling. Dessutom, genom att tillhandahålla gliaceller konditionering för dessa nervceller de kommer att fortsätta att utvecklas och bildar funktionella synapsförbindelser och efterlevande i flera månader i kulturen. I detta protokoll redogör vi för en teknik att dissekera, kultur och transfektera embryonala mus hippocampus och kortikala neuron. Transfektion sker genom electroporating DNA i nervceller innan bordläggningen via nucleofection. Detta protokoll har fördelen att uttrycka fluorescerande-märkta fusionsproteiner tidigt i utvecklingen (~ 4-8hrs efter plating) för att studera dynamiken och funktion av proteiner under polarisering, axon utväxt och förgrening. Vi har också upptäckt att denna enda transfektion innan plätering upprätthåller fluorescerande-märkta uttryck fusionsprotein vid nivåer lämpliga för avbildning hela livstid av neuron (> 2 månader i kultur). Således är denna metod användbar för att studera protein lokalisering och funktion i hela CNS-utveckling med små eller inga störningar i neuronal funktion.

Protocol

1. Beredning av Täckglas och Chambers

1. Beredning av rena täckglas och kammare är avgörande för friska kulturer. Genvägar bör inte tas på någon av dessa steg.
2. Tvätta täckglas (12mm eller 22mm rund, tyska glas - Carolina Assistant Brand) över natten i koncentrerad salpetersyra (HNO3) i ett särskilt glasburk eller bägare.
3. Ta bort täckglasen från salpetersyra och tvätta omfattande (5-7x) i avjoniserat vatten.
4. Separera täckglas och torka i ett laminärt flöde huva eller biosäkerhet skåp. När det är torrt, sterilisera dem med UV-ljus i 30 minuter. Placera steriliseras täckglas i en steril petriskålar för förvaring. Om bordläggning nervceller på 12mm täckglas plats direkt täckglas i ett sterilt 35mm skålen och fortsätt till Avsnitt 2.
5. Imaging kammare konstrueras genom att borra ett 15mm hål i botten av 35 mm petriskålar (ta bort alla grader) och fästa rengöras täckglas med en 3:1 blandning av paraffin och vaselin.
6. Smält paraffin / vaselin blandning i en konisk tub inuti ett kokande vattenbad. Använd en liten pensel och päls på undersidan av skålen runt 15mm hål. Se till att hålla röra i paraffin / vaselin blandning eftersom det kommer att separera. Detta resulterar oftast i olika avdelningar limmas ihop med en högre koncentration av vaselin, som blir trögflytande när rätterna är placerade i inkubatorn, vilket resulterar i täckglaset lossnar. Resterande paraffin / vaselin kan förvaras i rumstemperatur.
7. Placera skålen upp och ner på en platt bricka och placera täckglas över hålet. Värme i 80 ° C ugn tills paraffinet blandningen är smält (~ 10 minuter). Ta ut skålarna på en plan yta och låt som paraffin blandningen.
8. Vänd rätter över och sterilisera både insidan av lock och botten av kammare med UV-ljus.
9. Päls täckglas eller regioner glas kammare med 1.0mg/mL Poly-D-lysin (30kDa) i boratbuffert (0,1 miljoner natriumborat, pH 8,5) i en timme. Skölj 3-5 gånger med rikligt med vävnadsodling klass avjoniserat vatten. Se till att avlägsna alla spår av boratbuffert. Torr och använd omedelbart eller förvara kammare / täckglas för senare användning. Vi använder vanligtvis rengöras täckglas inom en månad efter beredning.

2. Beredning av Neuronal Dissection och kultur Medium

1. Förbered dissektion medium (DM) genom att lägga till lämpliga mängder av 10x HBSS och 100X HEPES att vävnadsodling årskurs vatten. Förvaras vid 4 ° C. Håll på is under dissekering.
2. Dagen före dissekering förbereda bordläggning medium (PM) och serumfritt medium (SFM). PM består av Neurobasal Medium, B27 komplettera, 2 mM glutamin, 0,3% glukos, 37,5 mM NaCl och 5% fetalt bovint serum (FBS). SFM består av Neurobasal Medium, B27 komplettera, 2 mM glutamin, 0,3% glukos och 37,5 mM NaCl.
3. Gör bara tillräckligt för dissekering och förvara i en vävnadsodling inkubator över natten med locket på glänt så att temperaturen och CO ₂ halt av mediet i jämvikt. Vi lägger extra glukos och öka osmolalitet till cirka 310mOsm med NaCl. Vi hittar de kulturer göra bättre på en mer fysiologisk osmolalitet (Neurobasal osmolalitet är normalt 205-245mOsm).

3. Kortikala gliaceller Feeder Layer Förberedelser för långa kulturer

1. Om långsiktiga kulturer att vara förberedd, utföra denna del av protokollet två till tre veckor innan du fortsätter med kortikala eller hippocampus dissektioner.
2. Förbered gliaceller medium (GM) med MEM, 0,3% glukos, penicillin / streptomycin och 10% häst serum.
3. Euthanize P1-P3 mus ungar genom att kyla på is i 5 minuter. Ta bort varje valp från isen och spraya med 70% etanol. Snabbt halshugga med en sax. Ta bort hela hjärnan till en maträtt som innehåller kallt DM (steg 2,1).
4. Ta bort de två hjärnhalvorna och hjärnhinnorna. Punktskatter på hjärnbarken och flytta till en ny maträtt som inte innehåller några medier. Förbered cortex från 4 hjärnor totalt.
5. Finhacka cortex med en ren, steril rakblad så bra som möjligt och ta bort hackade vävnad med en plast pipett till en 50 ml koniskt rör som innehåller 12 ml kallt DM. Lägg till trypsin och DNas till slutlig koncentration av 0,25% (1,5 ml) och 0,1% (1,5 ml), respektive. Inkubera i 37 ° C vattenbad under 10 minuter med intermittent virvlande.
6. Ta bort röret med kortikala vävnaden och rengör noggrant med 70% etanol innan den lägger in i vävnadsodling huven. Pipettera kortikal vävnad upp och ner med en 10 ml pipett ungefär 10-15 gånger, eller tills de flesta bitar försvinner.
7. Återgå röret till 37 ° C i ett vattenbad i ytterligare 10 minuter med intermittent virvlande.
8. Rengör röret med 70% etanol och föra den tillbaka till vävnadsodling huven. Pipettera de kortikala vävnaden upp och ner med en 5 mL pipett ungefär 10-15 gånger, eller tills bitar försvinner.
9. Tillsätt 15 ml varmt GM och centrifugera vid 200xg (1000rpm) i 10 minuter.
10. Kassera supernatanten resuspendera pelleterat cellerna i 20 ml rent GM och räkna med en hemocytometer. Plate 5-7.5x10 ⁶ celler i 15 ml GM per 75cm ² kolv.
11. Efter en dag och var 2-3 påföljande dagar i kultur, få bort lösa celler genom att knacka kolven mot din hand. Ta bort mediet tillsammans med eventuella rubbas celler och ersätta med 15 ml rent GM.
12. Glia kan skördas efter 1-2 veckors tillväxt i kolvar, när de är ca 70-100% konfluenta. För att förbereda enskilda täckglas belagd med Glia, plats 6 salpetersyra rengöras och steriliseras 25mm runt täckglas i en 10 cm skål, och placera tre prickar i 3:01 blandning av paraffin / vaselin på varje täckglas i en trekantig mönster med en liten pensel . Behandla öppna rätter med UV-ljus i 30 minuter. Täck täckglas med 0,1 mg / ml Poly-D-lysin (30kDa) i boratbuffert en timme, tvätta sedan omfattande (3-5x) med steril vävnadsodling klass avjoniserat vatten och låt torka.
13. Ta bort gliaceller som innehåller kolven ur inkubatorn, kassera mediet och skölj med 5 ml förvärmda trypsin / EDTA-lösning. Ta bort trypsin / EDTA-lösning från kolven och Pipettera över 3 ml färsk förvärmda trypsin / EDTA i kolven. Inkubera kolven i 1 minut vid 37 ° C före tillsats av 5 ml av GM för att stoppa trypsinization.
14. Ta bort Glia från kolven genom upprepad pipettering 10-15 gånger, och sedan överföra media till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera vid 200xg (1000rpm) i 8 minuter. Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 ml av GM, celler räkna och platta 5x10 ⁵ celler i 12,5 ml av GM per 10cm maträtt som innehåller täckglas.
15. Börsen mediet med färska förvärmda GM var 2-3 dagar. Dagen före neuron dissekering, ta bort GM och ersätt med SFM (avsnitt 2.2). Använd denna gliaceller med luftkonditionering SFM i steg 4,12 när översvämningar kortikala eller hippocampus kulturer.

4. Kortikala Och / eller hippocampus Dissection och elektroporation

1. Ta lämpliga mängder nucleofection lösningar (Lonza), kombinera och värmas upp till rumstemperatur innan du startar dissekering. Sedan Nucleofection lösning har en begränsad livslängd när de kombineras, kombinerar vi bara det belopp som behövs för varje beredning (100 mikroliter per transfektion).
2. Euthanize en gravid mus vid E15.5 med CO ₂ (dag kontakten är E0.5) och ta bort livmodern på en 10 cm petriskål. Ta bort foster och halshugga i kallt DM (avsnitt 2.1).
3. Ta bort hela hjärnan till en separat skål med kallt DM och med en böjd volfram nål, ta bort båda neocortices. Ta bort hjärnhinnorna med microforceps och cortices plats i nya fat med kallt DM. Med en liten iris eller Wecker saxar, ta bort barken eller hippocampus och plats i ett 1,5 ml Eppendorf-rör fyllt med 1,0 ml kallt DM. Håll detta rör på is.
4. Efter att dissekera allt cortex eller hippocampi, tillsätt 110 mikroliter på 2,5% trypsin till Eppendorf-rör som innehåller vävnad och placera röret i 37 ° C inkubator i 20 minuter.
5. Avlägsna supernatanten och skölj cortices eller hippocampi med 1,0 mL PM (avsnitt 2.2) genom att försiktigt vända Eppendorf-rör. Upprepa tvätta två gånger, vilket 1 mL av PM i röret.
6. Mal sönder bitar 15 gånger med en P1000 pipett, och ta bort supernatanten / cellerna till ett nytt 15 ml koniska rör med 4 mL PM, lämna några bitar som finns kvar i Eppendorf-rör.
7. Snurra 15 ml tub i 20xg (350rpm) i 7 minuter med bromsen avstängd. Kassera supernatanten och tillsätt 100 mikroliter av förblandade, rumstemperatur nucleofection lösning (Lonza) för varje transfektion. Mal sönder 5 gånger med en lätt upp och ner rörelse P1000 pipetten.
8. Ta bort 100 mikroliter av nucleofection lösning / cell blandningen till varje ny Eppendorf-rör och tillsätt lämplig mängd DNA. För långsiktig kulturer använder vi vanligen 1-2μg av DNA per transfektion. Men detta endast etiketter en liten <10% andel av nervceller i kulturen. Vi använder i regel 5-10 mikrogram av DNA per transfektion om vill högre transfektion effektivitet för kortsiktiga kultur. Vi har använt upp till totalt 40μg av DNA när transfecting med två olika plasmider. Plasmider lagras i TE buffert vid 1μg / mikroliter.
9. Lägg cellsuspension / DNA till kyvett (Lonza) och electroporate cellerna i Nucleofector (Lonza), med hjälp av programmet O-005 (mus CNS neuroner).
10. Arbeta snabbt, lägg till 500 mikroliter av förvärms och jämvikt PM till kyvetten och ta bort lösningen / cellerna till ett nytt 1,5 ml Eppendorf-rör. Lägg tillräckligt PM för att få volymen för varje transfektion till 1,0 ml. Räkna celler med en hemocytometer och platta vid 3-5x10 ³ celler / cm ² för unga kulturer, eller 5-10x10 ³ celler / cm ² för långsiktig kulturer. </ Li>
11. För kortvariga kulturer, översvämma 35mm kultur rätter med 2,0 ml uppvärmd, CO _2-jämvikt SFM efter en timmes plätering. Om du använder täckglas, vi bort hälften av de PM och ersätta det med SFM, upprepa sedan två gånger till. Antingen översvämningar avbildning avdelningar eller tvätta täckglasen resulterar i en mycket låg serum-halt (<0,5%). Kortsiktiga kulturerna behöver inte vara odlade med en gliaceller feeder lager och behöver inte på nytt matas.
12. För långsiktiga kulturer, tar vi bort en Glia täckt täckglas som innehåller tre punkter i paraffin / vaselin och invertera det över 15mm hål i 35mm skålen, en timme efter första plätering. Två milliliter av det betingade SFM från gliaceller skålen läggs sedan till den avbildning kammaren. Att mata långsiktiga kulturer, tar vi bort en tredjedel av SFM var 2-3 dagar och ersätta det med färskt, förvärms och CO _2-jämvikt SFM.

5. Representativa resultat:

Figur 1. Living hippocampus nervceller i successiva stadier av utveckling. Kopplade bilder av representativa levande hippocampus nervceller visas som både en differential interferens kontrast bild och en motsvarande fluorescerande mikroskop. Var och en av dessa celler har transfekterade med EGFP-tubulin och DsRed2 i PCAX vektorer. De nervceller var avbildad på följande dagar in vitro (DIV): Etapp 1 (1DIV), etapp 2 (1DIV), etapp 3 (2DIV), etapp 4 (11DIV) och Etapp 5 (32DIV). Skala bar är 20 mikroM.

Discussion

Detta protokoll för odling embryonala hippocampus och hjärnbarken mus nervceller utvecklades som en modifikation av Bankiren-protokollet, som använder råtta neuron ^1,2. Vi har använt detta protokoll för odling mus och nervceller hamstern också ^3,4,5,6,7. Detta protokoll fungerar lika bra för både hippocampus och hjärnbarkens nervceller och liknar ett protokoll som offentliggjorts av Meberg och Miller ^8. Generellt använder vi hippocampus nervceller för långsiktig kultur eftersom de är väl beskriven och ett mer etablerat modellsystem. Dessutom kommer de sannolikt att innehålla en mer homogen population av nervceller än neocortex. Men hjärnbarkens nervceller odlade med hjälp av detta protokoll också överleva och differentiera på samma sätt (opublicerade data). Vi använder rutinmässigt hippocampus och hjärnbarkens nervceller för kortsiktiga kultur. Dissekering av neocortex leder också till betydligt mer neuroner (1.5x10 ⁶ nervceller per par av cortex) än hippocampus dissektion (2.5x10 ⁵ nervceller per par hippocampi), vilket gör det ett bättre val av material för Western blotting, till exempel.

Som med alla primära kultur, är det viktigt att minimera den tid det tar från det att djuret har dött till bordläggning av cellerna. Det görs i regel 10-20 dissektioner att bli konsekvent snabb på dissekering och plätering. Även när du arbetar med Lonza Nucleofector är det viktigt att arbeta snabbt under elektroporation förfarandet, såsom livskraft nervceller minskar snabbt om de är kvar i nucleofection buffert.

Mycket av vårt bildhantering sker med en total inre reflektans fluorescensmikroskopi (TIRFM). Denna typ av mikroskopi kan endast avbildning flera hundra nanometer bortom täckglas. Därför är de områden av nervceller som vi ofta bild, axonal tillväxt konen och ryggar dendritiska, måste följas direkt på täckglas. Därför använder vi låg densitet kulturer som kräver gliaceller utfodring för långsiktig kultur. Vi har använt högre densitet kulturer (> 2x10 ⁴ celler / cm ^2), utan gliaceller feeder lager, för långsiktig kulturer och fann att de överlever mycket bra med lite utfodring. Men Dendritutskotten av dessa nervceller är ofta nog för långt bort från underlaget till bilden i TIRFM, även om de lätt kan upptäckas med brett fält mikroskopi eller konfokalmikroskopi.

I de flesta av våra studier har vi transfektera nervceller innan plätering, och har avbildat fluorescerande-märkta proteiner upp till tre månader i kulturen. Denna långsiktiga uttryck av fluorescerande-märkta proteiner ger oss förtroende att genom att använda låga koncentrationer av DNA (1-2μg) att vi inte producerar överuttryck artefakter i nervceller. Däremot kan detta förfarande också användas för att studera överuttryck av protein om stora mängder av DNA som används (10-20μg). Den plasmider som vi använder för att transfektera nervceller innehåller vanligtvis EGFP eller mCherry fusionsproteiner, även om vi också märka neuronala cytoplasman med DsRed2 eller EGFP ensam. Detta elektroporation tekniken fungerar bra med ett antal vektorer. Vi föredrar plasmider som innehåller en β-aktin promotor med CMV förstärkare och β-globin poly-A svans (pCAGGs eller PCAX plasmider) ^9, på grund av den relativt höga nivåer av uttryck, och det faktum att de är väl tolereras av nervceller på både kort och lång sikt kultur. Generellt proteiner börjar uttrycka inom ca 4 timmar bordläggningen och nådde tillräcklig för bildbehandling inom 10-24 timmar ^10. Vi har framgångsrikt använt CMV-promotor-driven plasmider i kortfristiga kulturer, men har funnit att de kan orsaka höga nivåer av överuttryck som dödar nervceller i långsiktig kultur. Vi har dock funnit att gliaceller konditionering av låg densitet kulturer bidrar med överlevnaden av nervceller transfererats med CMV-promotorn driven plasmider, jämfört med högre densitet (icke-gliaceller matade) kulturer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Borate	Fisher Scientific	S93356	Store borate buffer at room temperature (RT).
Poly-d-Lysine	Sigma-Aldrich	P7886-100mg	Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C.
Trypsin (10x)	Invitrogen	15090-046	Store aliquots at -80°C.
DNase (10x)	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Store aliquots at -80°C.
MEM	Invitrogen	11095-080	Store at 4°C.
HBSS (10x)	Invitrogen	14185-052	Store at RT.
HEPES (100x)	Invitrogen	15630-080	Store at 4°C.
Penicillin/Streptomycin (100x)	Invitrogen	15140-122	Store aliquots at -80°C.
Horse Serum	Hyclone	SH3007403	Store aliquots at -80°C.
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25200-056	Store at 4°C.
Neurobasal E (NB)	Invitrogen	21103-049	Store at 4°C.
B27 Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044	Store aliquots at -80°C.
Glutamine (100x)	Invitrogen	25030-081	Store aliquots at -80°C
30% Glucose in NB (100X)	Fisher Scientific	BP350-500	Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C.
3.75M NaCl in NB (100X)	Fisher Scientific	BP358-1	Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH3007003	Store aliquots at -80°C.
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w)	Fisher Scientific	Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1	Combine in conical tube and melt in boiling water.
Concentrated Nitric Acid (HNO3)	Fisher Scientific	A509-212	Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows.
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X)	Sigma-Aldrich	C6645	Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.