Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Abstract

Hippokampalen und kortikalen Neuronen wurden ausgiebig auf das zentrale Nervensystem (ZNS) neuronalen Polarisation, Axon / Dendriten Auswuchs, und Synapsenbildung und Funktion Studie verwendet. Ein Vorteil der Kultivierung dieser Neuronen ist, dass sie leicht zu polarisieren, bilden markante Axonen und Dendriten, auf einer zweidimensionalen Substrat bei sehr geringen Dichten. Diese Eigenschaft hat sie extrem nützlich für die Bestimmung viele Aspekte der neuronalen Entwicklung. Darüber hinaus, indem sie Gliazellen Klimaanlage für diese Neuronen werden sie weiter zu entwickeln, bilden funktionelle synaptische Verbindungen und Überleben für einige Monate in Kultur. In diesem Protokoll skizzieren wir eine Technik zu sezieren, Kultur und Transfektion von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen. Die Transfektion wird durch Elektroporation von DNA in die Neuronen vor dem Ausplattieren über Nukleofektion erreicht. Dieses Protokoll hat den Vorteil, auszudrücken Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine ​​früh in der Entwicklung (~ 4-8h nach dem Ausplattieren), um die Dynamik und Funktion von Proteinen während der Polarisation, Axon Auswuchs und Verzweigung zu studieren. Wir haben auch entdeckt, dass diese einzelne Transfektion vor dem Ausplattieren Fluoreszenz-markierten Fusionsproteins Ausdruck unterhält auf einem Niveau angemessen für die Bildgebung während der gesamten Lebensdauer des Neurons (> 2 Monate in Kultur). Somit ist diese Methode zur Untersuchung von Protein-Lokalisation und Funktion im gesamten ZNS-Entwicklung mit wenig oder gar keine Störung der neuronalen Funktion.

Protocol

1. Vorbereitung der Deckgläser und Chambers

1. Vorbereitung von sauberen Deckgläschen und Kammern ist wichtig für gesunde Kulturen. Shortcuts sollten nicht auf jeder dieser Schritte unternommen werden.
2. Waschen Sie die Deckgläser (12mm oder 22mm rund, deutsche Glas - Carolina Assistant Brand) über Nacht in konzentrierter Salpetersäure (HNO3) in einem speziellen Glas oder Becher.
3. Deckgläser abnehmen Salpetersäure und wäscht intensiv (5-7x) in destilliertem Wasser.
4. Trennen Sie die Deckgläser und trocken in einer Sterilbank oder Biosicherheitswerkbank. Nach dem Trocknen, Sterilisieren sie mit UV-Licht für 30 Minuten. Ort sterilisiert Deckgläschen in eine sterile Petrischalen für die Lagerung. Wenn plating Neuronen auf 12mm Deckgläser direkt Platz Deckgläser in einer sterilen 35-mm-Schale und fahren Sie mit Abschnitt 2.
5. Imaging Kammern sind durch Bohren eines 15mm-Loch in der Unterseite 35mm Petrischalen (entfernen Sie alle Grate) und Anbringen der gereinigten Deckgläser mit einem 3:1-Gemisch aus Paraffin und Vaseline gebaut.
6. Melt das Paraffin / Vaseline-Gemisch in einem konischen Rohr in einem siedenden Wasserbad. Mit einem kleinen Pinsel und Beschichtung der Unterseite der Schale um die 15mm Loch. Achten Sie darauf, immer schön rühren das Paraffin / Vaseline-Gemisch, wie es getrennt werden. Dies führt in der Regel Kammern zusammen mit einer höheren Konzentration von Vaseline, die viskosen werden wird, wenn Gerichte in den Inkubator gelegt, was in Deckglas Ablösung geklebt. Die restlichen Paraffin / Vaseline kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
7. Die Schale nach oben auf eine flache Schale und legen Sie das Deckglas über dem Loch. Hitze in 80 ° C im Ofen, bis Paraffin-Gemisch geschmolzen ist (~ 10 Minuten). Entfernen Sie Speisen auf eine ebene Fläche und lassen Sie die Paraffin-Gemisch eingestellt.
8. Schalten Sie das Geschirr über und sterilisieren sowohl die Innenseiten der Deckel und die Böden der Kammern mit UV-Licht.
9. Coat Deckgläser oder Glas Regionen Kammern mit 1.0mg/mL Poly-D-Lysin (30-kDa) in Boratpuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,5) für eine Stunde. Spülen Sie 3-5 mal mit reichlich Gewebekultur grade deionisiertem Wasser. Vergewissern Sie sich, um alle Spuren von Borat-Puffer zu entfernen. Trockene und sofort verwenden oder lagern Kammern / Deckgläser für die spätere Verwendung. Wir verwenden normalerweise gereinigt Deckgläser innerhalb von einem Monat der Vorbereitung.

2. Vorbereitung der Neuronale Dissection und Kulturmedium

1. Bereiten Sie die Dissektion (DM) durch Zugabe entsprechender Mengen von 10x HBSS und 100X HEPES auf Gewebekultur-Wasser. Lagerung bei 4 ° C. Keep on ice während der Präparation.
2. Am Tag vor der Dissektion Vorbereitung der Beschichtung Medium (PM) und Serum-freiem Medium (SFM). PM besteht aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, 2 mM Glutamin, 0,3% Glucose, 37,5 mM NaCl und 5% fötales Rinderserum (FBS). SFM besteht aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, 2 mM Glutamin, 0,3% Glucose und 37,5 mM NaCl.
3. Machen Sie nur so viel für die Zerlegung und Speicherung in einer Gewebekultur-Inkubator über Nacht mit der Kappe leicht geöffnet, so dass die Temperatur und CO _2-Gehalt des Mediums im Gleichgewicht. Wir fügen zusätzliche Glukose und erhöhen die Osmolalität auf rund 310mOsm mit NaCl. Wir finden die Kulturen besser zu einem mehr physiologischen Osmolalität (Neurobasal Osmolalität ist in der Regel 205-245mOsm).

3. Kortikale Glial Feeder-Layer Vorbereitung für Langzeit-Kulturen

1. Wenn langfristig Kulturen hergestellt werden sollen, führen Sie diesen Teil des Protokolls zwei vor drei Wochen vor Fortsetzung der kortikalen oder Hippocampus Dissektionen.
2. Bereiten Gliazellen Medium (GM) mit MEM, 0,3% Glucose, Penicillin / Streptomycin und 10% Pferdeserum.
3. Euthanize P1-P3 Maus Welpen durch Kühlung auf Eis für 5 Minuten. Nehmen Sie jedes Jungtier aus dem Eis und Spray mit 70% Ethanol. Schnell köpfen mit einer Schere. Entfernen Sie das gesamte Gehirn eine Schüssel mit kaltem DM (Schritt 2,1).
4. Entfernen Sie die beiden Gehirnhälften und der Hirnhäute. Excise des Neokortex und zu entfernen, um ein neues Gericht, die keine Medien. Bereiten Kortex von 4 Gehirne insgesamt.
5. Mince den Kortex mit einem sauberen, sterilen Rasierklinge so fein wie möglich und entfernen gehackte Gewebe mit einer Kunststoff-Pipette auf eine 50 ml konische Röhrchen mit 12 ml kaltem DM. Add Trypsin und DNase, um Endkonzentrationen von 0,25% (1,5 ml) und 0,1% (1,5 ml) bzw.. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten mit intermittierendem Schwenken.
6. Entfernen Sie das Röhrchen mit dem kortikalen Gewebe und gründlich reinigen mit 70% Ethanol vor Inbetriebnahme der Gewebekultur Kapuze. Pipet kortikalen Gewebe nach oben und unten mit einer 10 ml Pipette ca. 10-15 mal, oder bis die meisten Stücke verschwinden.
7. Senden Sie das Rohr auf 37 ° C im Wasserbad für weitere 10 Minuten mit intermittierendem Schwenken.
8. Reinigen Sie das Rohr mit 70% Ethanol und bringen sie zurück in die Gewebekultur Kapuze. Pipettieren der kortikalen Gewebe nach oben und unten mit einem 5 mL Pipette ca. 10-15 mal, oder bis zum Brocken verschwinden.
9. 15 ml warmes GM und Zentrifuge bei 200xg (1000rpm) für 10 Minuten.
10. Überstand resuspendieren die pelletierten Zellen in 20 ml frisches GM und zählen mit einer Zählkammer. Platte 5-7.5x10 ⁶ Zellen in 15 ml GM pro 75 cm ^2-Kolben.
11. Nach einem Tag und alle 2-3 aufeinander folgenden Tagen in Kultur, zu vertreiben lose Zellen durch Klopfen der Flasche gegen die Hand. Entfernen Sie das Medium zusammen mit allen verdrängt Zellen und ersetzen mit 15 ml frischem GM.
12. Glia kann nach 1-2 Wochen des Wachstums in den Kolben geerntet werden, wenn sie ca. 70-100% konfluent sind. Zur Vorbereitung einzelner Deckgläser mit Glia beschichtet, gereinigt Platz 6 Salpetersäure und sterilisiert 25mm runden Deckgläschen in einer 10 cm Schüssel, und Platz 3 Punkte des 3:1-Gemisch aus Paraffin / Vaseline auf jedes Deckglas in einem dreieckigen Muster mit einem kleinen Pinsel . Gönnen offene Küche mit UV-Licht für 30 Minuten. Bestreichen Sie die Deckgläser mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin (30-kDa) in Borat-Puffer für eine Stunde, dann ausgiebig waschen (3-5x) mit steriler Gewebekultur grade VE-Wasser und trocknen lassen.
13. Entfernen Sie die Glia-haltigen Flasche aus Inkubator, entsorgen Sie die Medium und spülen mit 5 ml vorgewärmten Trypsin / EDTA-Lösung. Entfernen Sie das Trypsin / EDTA-Lösung aus dem Kolben und Pipette 3 ml frisches vorgewärmtes Trypsin / EDTA in die Flasche. Inkubieren Sie die Flasche für 1 Minute bei 37 ° C vor Zugabe von 5 ml GM die Trypsinierung stoppen.
14. Entfernen Sie die Glia von Kolben durch wiederholtes Pipettieren 10-15 Mal, und übertragen Sie dann die Medien zu einer 15 mL konischen Rohr. Zentrifuge bei 200xg (1000rpm) für 8 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und 10 ml GM, Zählen von Zellen, und die Platte 5x10 ⁵ Zellen in 12,5 ml GM pro 10cm Schüssel mit dem Deckgläschen.
15. Austausch des Mediums mit frischem vorgewärmten GM alle 2-3 Tage. Am Tag vor dem Neuron Dissektion, entfernen Sie die GM und ersetzen mit SFM (Abschnitt 2.2). Mit dieser Gliazellen klimatisierten SFM in Schritt 4.12 Bei Überschwemmungen kortikalen oder Hippocampus Kulturen.

4. Kortikale und / oder Hippocampus Dissection und Elektroporation

1. Entfernen entsprechender Mengen Nukleofektion Lösungen (Lonza), kombinieren und auf Raumtemperatur erwärmt, bevor das Sezieren. Da Nucleofection Lösung hat eine begrenzte Lebensdauer, wenn kombiniert, wir nur kombinieren die benötigte Menge für jedes Präparat (100 ul pro Transfektion).
2. Euthanize eine schwangere Maus E15.5 mit CO ₂ (Tag der Stecker E0.5) und entfernen die Gebärmutter auf eine 10cm Petrischale. Entfernen Föten und zu enthaupten ins kalte DM (Abschnitt 2.1).
3. Entfernen Sie das gesamte Gehirn in eine separate Schüssel kaltes DM und mit einem gebogenen Wolframnadel, entfernen Sie beide neocortices. Entfernen Sie die Hirnhäute mit microforceps und Ort Kortex in neue Schüssel kaltes DM. Mit einer kleinen Blende oder Wecker Schere, entfernen Sie die Rinde oder Hippocampus und in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1,0 ml kaltem DM gefüllt. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis.
4. Nach seziert alle Rinden oder hippocampi, fügen Sie 110 ul 2,5% Trypsin, die Eppendorf-Röhrchen mit dem Gewebe und Ort Rohr in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten.
5. Entfernen Sie den Überstand und wäscht Kortex oder hippocampi mit 1,0 mL PM (Abschnitt 2.2) durch vorsichtiges Umdrehen des Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, so dass 1 ml PM in die Röhre.
6. Man reibt die Stücke 15 Mal mit einem P1000 Pipette, und entfernen Sie überstehende / Zellen zu einem neuen 15 ml konische Röhrchen mit 4 ml PM, so dass keine Klumpen, die bleiben in Eppendorf-Röhrchen.
7. Drehen Sie die 15 ml Tube bei 20xg (350rpm) für 7 Minuten mit der Bremse ausgeschaltet. Überstand verwerfen und 100 ul der vorgemischten, Raumtemperatur Nukleofektion Lösung (Lonza) für jede Transfektion. Man reibt 5 mal mit einem sanften Auf-und Abbewegung des P1000 Pipette.
8. Nehmen Sie 100 ul der Nukleofektion Lösung / Zellgemisch auf jede neue Eppendorf-Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Menge an DNA. Für die langfristige Kulturen, die wir verwenden in der Regel 1-2μg DNA pro Transfektion. Dies ist jedoch nur eine kleine Etiketten <10% Anteil der Neuronen in der Kultur. Wir verwenden in der Regel 5-10 ug DNA pro Transfektion, wenn höhere Transfektionseffizienz für kurzfristige Kultur wollen. Wir haben bis zu einem Gesamtbetrag von 40μg DNA verwendet werden, wenn die Transfektion mit zwei verschiedenen Plasmiden. Plasmide sind in TE-Puffer bei 1 g / ul gespeichert.
9. Add Zellsuspension / DNA in die Küvette (Lonza) und elektroporieren die Zellen in der Nucleofector (Lonza), mit dem Programm O-005 (Maus ZNS-Neuronen).
10. Arbeiten schnell, 500 ul vorgewärmtes und äquilibriert PM in die Küvette und entfernen Lösung / Zellen in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie genug PM, um die Lautstärke der einzelnen Transfektion bis 1,0 mL zu bringen. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und Platte bei 3-5x10 ³ Zellen / cm ² für junge Kulturen, oder 5-10x10 ³ Zellen / cm ² für die langfristige Kulturen. </ Li>
11. Für kurzfristige Kulturen, Überschwemmung des 35-mm-Kulturschalen mit 2,0 ml erwärmt, CO _{2-Gleichgewicht} SFM nach einer Stunde Beschichtung. Bei Verwendung von Deckgläsern, wir die Hälfte entfernen des PM und ersetzen sie durch SFM, dann noch zweimal wiederholen. Entweder Überflutung der Imaging-Kammern oder Waschen der Deckgläschen führt zu einer sehr niedrigen Serum-Gehalt (<0,5%). Kurzfristige Kulturen brauchen nicht mit einer glialen Feeder-Schicht kultiviert werden und müssen nicht wieder zugeführt werden.
12. Für die langfristige Kulturen, entfernen wir eine Glia gedeckt Deckglas mit drei Punkten aus Paraffin / Vaseline und invertieren sie über das 15mm Loch in die Schale 35mm, 1 Stunde nach der ersten Beschichtung. Zwei Milliliter der konditionierten SFM aus der Glia-Schüssel wird dann auf den Imaging-Kammer aufgenommen. Zur Speisung der langfristigen Kulturen, entfernen wir ein Drittel des SFM alle 2-3 Tage und ersetzen sie durch frische, vorgewärmte und CO _{2-Gleichgewicht} SFM.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Wohnen Hippocampus-Neuronen in aufeinanderfolgenden Stadien der Entwicklung. Gepaart Bilder von repräsentativen Wohn Hippocampus-Neuronen sind nicht nur als ein Differential-Interferenz-Kontrast Bild und eine entsprechende Fluoreszenzaufnahme gezeigt. Jede dieser Zellen hat mit EGFP-Tubulin und DsRed2 in pCAX Vektoren transfiziert wurden. Stufe 1 (1cm), Stufe 2 (1cm), Stufe 3 (2DIV), Stage 4 (11DIV) und Stufe 5 (32DIV): Die Neuronen wurden in den folgenden Tagen in vitro (DIV) abgebildet. Scale-Bar ist 20 um.

Discussion

Dieses Protokoll zur Kultivierung von embryonalen hippokampalen und kortikalen Neuronen der Maus wurde als eine Modifikation der Banker-Protokoll, das Rattenneuronen ^1,2 verwendet entwickelt. Wir haben dieses Protokoll zur Kultivierung von Maus und Hamster Neuronen verwendet sowie ^3,4,5,6,7. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut für beide Hippocampus und Neokortex Neuronen und ist vergleichbar mit einem Protokoll, das von Meberg und Miller ⁸ veröffentlicht. Generell verwenden wir Hippocampus-Neuronen für die langfristige Kultur, weil sie gut charakterisiert sind und ein etabliertes Modell-System. Darüber hinaus sind sie wahrscheinlich zu einer homogenen Population von Neuronen als Neocortex enthalten. Allerdings kultivierten Neuronen Neokortex mit diesem Protokoll auch überleben und differenzieren ähnlich (unveröffentlichte Daten). Wir verwenden routinemäßig Hippocampus und Neokortex Neuronen für kurzfristige Kultur. Präparation des Neokortex führt auch zu wesentlich mehr Neuronen (1.5x10 ⁶ Neuronen pro Paar Kortex) als Hippocampus Dissektion (2.5x10 ⁵ Neuronen pro Paar hippocampi), das es eine bessere Auswahl des Materials für Western-Blot, zum Beispiel macht.

Wie bei allen primären Kultur, ist es wichtig, die Zeit, die vom Tod des Tieres, um die Plattierung der Zellen zu minimieren. Es dauert in der Regel 10-20 Dissektionen zu werden konstant schnell zu Dissektion und Beschichtung. Auch beim Arbeiten mit der Lonza Nucleofector, ist es wichtig, schnell zu arbeiten während der Elektroporation Verfahren, wie die Lebensfähigkeit der Nervenzellen schnell abnimmt, wenn sie in der Nukleofektion Puffer übrig sind.

Ein Großteil unserer Bildgebung ist mit einem inneren Reflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) durchgeführt. Diese Art der Mikroskopie ist nur in der Lage Bildgebung mehreren hundert Nanometern über dem Deckglas. Daher werden die Bereiche der Neuronen, die wir häufig image, müssen die axonale Wachstum Kegel und dendritischen Dornen, direkt an das Deckglas eingehalten werden. So verwenden wir low density Kulturen, die Gliazellen Fütterung benötigen für die langfristige Kultur. Wir haben eine höhere Dichte Kulturen eingesetzt (> 2x10 ⁴ Zellen / cm ^2), ohne Gliazellen Feeder Schichten, für die langfristige Kulturen und festgestellt, dass sie sehr gut überleben mit wenig füttern. Allerdings sind die dendritischen Dornen dieser Neurone oft zu weit weg vom Substrat zum Bild in TIRFM, obwohl sie leicht mit Weitwinkel-Mikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie nachgewiesen werden.

In den meisten unserer Studien haben wir transfizieren Neuronen vor dem Ausplattieren und abgebildet fluoreszenzmarkierten Proteine ​​für bis zu drei Monate in Kultur. Diese langfristige Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen gibt uns die Zuversicht, dass durch niedrige Konzentrationen von DNA (1-2μg) sind wir nicht produzieren Überexpression Artefakte in den Neuronen. Allerdings kann dieses Verfahren auch zur Überexpression von Proteinen untersucht werden, ob große Mengen von DNA verwendet werden (10-20mg) werden. Die Plasmide, die wir verwenden, um Neuronen transfizieren enthalten in der Regel EGFP oder mCherry Fusionsproteine, obwohl wir auch Label das neuronale Zytoplasma mit DsRed2 oder EGFP allein. Diese Elektroporation Technik funktioniert gut mit einer Reihe von Vektoren. Wir bevorzugen Plasmide, die eine β-Aktin-Promotor mit einer CMV-Enhancer und β-Globin enthalten poly-A-Schwanz (pCAGGs oder pCAX Plasmide) ^9, aufgrund der relativ hohen Niveau des Ausdrucks, und die Tatsache, dass sie gut von den Neuronen geduldet in kurz-und langfristige Kultur. Im Allgemeinen beginnt Proteine ​​innerhalb von ca. 4 Stunden plating auszudrücken und erreichen Werte ausreichend für die Bildgebung in 10-24h ^10. Wir haben erfolgreich CMV-Promotor getriebene Plasmide in kurzfristige Kulturen verwendet, haben aber festgestellt, dass sie ein hohes Maß an Überexpression dazu führen, dass zu töten Nervenzellen in langfristige Kultur. Trotzdem haben wir festgestellt, dass die Gliazellen Konditionierung von low density Kulturen mit dem Überleben von Neuronen mit CMV-Promotor angetrieben Plasmiden transfiziert hilft, im Vergleich zu höheren Dichte (non-Glia-fed) Kulturen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Borate	Fisher Scientific	S93356	Store borate buffer at room temperature (RT).
Poly-d-Lysine	Sigma-Aldrich	P7886-100mg	Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C.
Trypsin (10x)	Invitrogen	15090-046	Store aliquots at -80°C.
DNase (10x)	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Store aliquots at -80°C.
MEM	Invitrogen	11095-080	Store at 4°C.
HBSS (10x)	Invitrogen	14185-052	Store at RT.
HEPES (100x)	Invitrogen	15630-080	Store at 4°C.
Penicillin/Streptomycin (100x)	Invitrogen	15140-122	Store aliquots at -80°C.
Horse Serum	Hyclone	SH3007403	Store aliquots at -80°C.
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25200-056	Store at 4°C.
Neurobasal E (NB)	Invitrogen	21103-049	Store at 4°C.
B27 Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044	Store aliquots at -80°C.
Glutamine (100x)	Invitrogen	25030-081	Store aliquots at -80°C
30% Glucose in NB (100X)	Fisher Scientific	BP350-500	Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C.
3.75M NaCl in NB (100X)	Fisher Scientific	BP358-1	Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH3007003	Store aliquots at -80°C.
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w)	Fisher Scientific	Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1	Combine in conical tube and melt in boiling water.
Concentrated Nitric Acid (HNO3)	Fisher Scientific	A509-212	Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows.
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X)	Sigma-Aldrich	C6645	Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.