L'induction et le suivi des actifs d'hypersensibilité de type retardé (DTH) chez les rats

Summary

Type de l'hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-lymphocytes T effecteurs mémoire. Ici nous démontrons comment provoquer SRD actifs chez le rat Lewis et de surveiller la réponse inflammatoire.

Abstract

Type de l'hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-lymphocytes T effecteurs mémoire qui infiltrent le site de l'injection d'un antigène contre lequel le système immunitaire a été amorcée. La réaction inflammatoire est caractérisée par une rougeur et une enflure du site de stimulation antigénique. C'est un modèle pratique pour déterminer l'efficacité in vivo d'immunosuppresseurs. SRD cutanée peut être induite soit par transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques d'antigènes ou par l'immunisation active avec un antigène, et les suivantes défi intradermique avec l'antigène pour induire la réaction inflammatoire dans une zone de peau donnés. Réponses DTH peuvent être induites à des antigènes différents, par exemple l'ovalbumine, la tuberculine, anatoxine tétanique, ou hémocyanine de patelle (KLH).

Ici nous démontrons comment provoquer une réaction active SRD chez le rat Lewis. Nous allons d'abord préparer une émulsion eau dans huile de KLH, notre antigène d'intérêt, dans l'adjuvant complet de Freund et injecter cette émulsion sous-cutanée à des rats. Ce sera le système immunitaire pour développer des cellules T mémoires dirigés à la KLH. Sept jours plus tard, nous mettra au défi les rats par voie intradermique sur le dos avec KLH d'un côté et avec de l'ovalbumine, un antigène non pertinents, de l'autre côté. La réaction inflammatoire sera visible de 16 à 72 heures plus tard et la zone rouge et enflée sera mesuré comme une indication de la gravité de SRD.

Protocol

1. Préparation de l'émulsion

1. L'émulsion est un mélange 1:1 de l'antigène (SRD peut être induite à des antigènes différents: l'ovalbumine, l'anatoxine tétanique, serrure patelle hémocyanine ....) en solution aqueuse ajoutée à l'adjuvant complet de Freund. Il est très important d'ajouter l'antigène à l'adjuvant et non l'inverse!
   
   
2. Il ya beaucoup de déchets lors de l'injection et une émulsion, il faut donc toujours se préparer 1,5 ou 2 fois plus que ce dont vous avez besoin.
   
   
3. Dissoudre l'antigène dans une solution saline pour préparer un 2 mg / ml solution. Ne pas filtrer, comme vous ne voulez pas perdre les agrégats!
   
   
4. Mettez complet de Freund adjuvant H37Ra (Difco, catalogue # 231131) dans un tube et le vortex à grande vitesse. Ajouter la chute de l'antigène à goutte tout en vortex. Lorsque tous de l'antigène est ajouté, vortex pendant 5 minutes. Le mélange doit devenir blanc.
   
   
5. Mettez l'émulsion dans une seringue en verre et de le relier à un autre seringue en verre à l'aide d'un pont 18G (catalogue Fisher n ° 14-825-17L). Envoyer l'émulsion d'une seringue à l'autre jusqu'à ce qu'il devienne dur (5-10 min). Il est préférable d'utiliser deux seringues de 5 ml. Si plus de 5 ml d'émulsion sont nécessaires, utiliser plusieurs ensembles de seringues de 5 ml.
   
   
6. L'émulsion peut être stockée dans les seringues à 4 ° C pendant 3 semaines.

2. L'immunisation des rats

1. Mélanger l'émulsion dans les seringues pendant quelques minutes et le transfert à la seringue utilisée pour l'injection. Injecter 200 ml par voie sous cutanée en 1-2 sites à la base de la queue à l'aide d'aiguilles 23G et un Luer-Lok pointe 3 mL.

3. Défi avec l'antigène dans le dos

1. Sept jours après la vaccination, se raser deux taches sur le dos des rats et injecter par voie intradermique 20 ml d'une solution à 1 mg d'antigène / ml dans un endroit et une solution saline (ou antigène non pertinent) à l'endroit d'autres. Ne pas filtrer la solution d'antigène, comme vous pouvez perdre des agrégats qui améliorent la réaction inflammatoire.
   
   
2. Les rats doivent être anesthésiés pour éviter les mouvements. Injecter la solution par voie intradermique à l'aide 27G ½ aiguilles et des seringues de 1 ml. Changer les aiguilles entre les injections.
   
   Remarque: le défi peut être fait dans le pavillon de l'oreille plutôt que de l'arrière pour des mesures plus précises. Voir la vidéo au http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Mesure de la SRD

1. Le site d'injection va commencer à tourner rouge et un gonflement comme un signe d'inflammation. Mesurez le diamètre de la zone enflammée à l'aide d'une règle ou, mieux encore, un étrier. Le gonflement maximal devrait se produire entre 24 et 72 heures.

Discussion

Pour une mesure plus précise de la réaction de DTH, nous recommandons contester le rat avec l'antigène dans le pavillon de l'oreille. La réaction peut alors être mesurée comme une différence dans l'oreille de l'enflure entre les antigènes concernés a contesté l'oreille et l'oreille a contesté avec une solution saline seule ou avec l'antigène pertinent. Une démonstration de relever le défi de l'oreille est montré dans 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.