हम में एक नकारात्मक चयन प्रणाली के विकास रिपोर्ट<em> ई. हिस्टोलिटिका</em> एक chimeric प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति (FCU1) और prodrug 5 fluorocytosine के साथ चयन पर आधारित है. FCU1 प्रोटीन खमीर साइटोसिन deaminase और phosphoribosyltransferase uracil के एक संलयन है. FCU1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई परिणामस्वरूप<em> ई. हिस्टोलिटिका</em5 – fluorocytosine की ओर संवेदनशीलता.
एटामोइबा हिस्टोलिटिका amebiasis की प्रेरणा का एजेंट है और विश्व की जनसंख्या का 10% अप करने के लिए संक्रमित है . आणविक तकनीक है कि ऊपर और जीन अभिव्यक्ति के नीचे विनियमन सक्षम है stably बनाए रखा plasmids के अभिकर्मक पर भरोसा करते हैं. जबकि इन एटामोइबा विषैलापन कारकों के बारे में हमारी समझ वृद्धि हुई है, क्षमता जीनोम, जो रिवर्स आनुवंशिकी प्रयोगों, एक महत्वपूर्ण लाभ इस परजीवी के अध्ययन में किया जाएगा अनुमति होगी exogenous डीएनए में एकीकृत करने के लिए. इस जीव द्वारा प्रस्तुत चुनौतियों मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटनाओं और कठिनाई ट्रांसफ़ेक्ट ट्रोफोजोइट्स से episomal प्लास्मिड डीएनए इलाज के लिए चयन करने में असमर्थता शामिल हैं. exogenous डीएनए, ट्रोफोजोइट्स जिसमें एक सदाशयी जीनोमिक एकीकरण घटना हुई है की पहचान करने में एक प्रमुख समस्या के एक उच्च पृष्ठभूमि में बाद में परिणाम है. हम एक नकारात्मक चयन एक खमीर साइटोसिन deaminase और phosphoribosyl transferase कल्पना (FCU1) 5 fluorocytosine prodrug (5 एफसी) के साथ चयन और uracil के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति पर आधारित प्रणाली के विकास रिपोर्ट. FCU1 एंजाइम विषाक्त 5 fluorouracil और 5 fluorouridine – 5'-monophosphate ई. में गैर विषैले 5 एफसी धर्मान्तरित हिस्टोलिटिका FCU1 व्यक्त लाइनों के लिए 30 गुना अधिक नियंत्रण तनाव की तुलना में prodrug के प्रति संवेदनशील होना पाया गया.
यद्यपि वहाँ एटामोइबा आणविक जैविक उपकरण में पर्याप्त प्रगति की गई है वहाँ कोई मौजूदा तरीकों को हटाने या 4 जीन को बाधित करने के लिए उपलब्ध हैं. जीन विशिष्ट अभिव्यक्ति की पछाड़ना सड़क के ढालवाँ 5 RNAs, छोटे दखल शाही सेना 6 के उपयोग द्वारा हासिल किया गया है और bacterially dsRNA 7 व्यक्त. हालांकि इन तरीकों संबंधित लक्ष्य जीन के लिए प्रभावी, जबकि महंगा रसायन, एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ निरंतर चयन और निरंतर प्रत्यावर्तन के उच्च घटना के समय पर होने वाली (एलिसिया Linford, व्यक्तिगत संचार) 8 कारण मान्यता के लिए जरूरत के उपयोग सहित कई सीमाएं हैं.
एटामोइबा में कोई प्लाज्मिड को दोहराने के रूप में वहाँ जाहिरा तौर पर डीएनए प्रतिकृति 9 की मूल के लिए एक सख्त अनुक्रम आवश्यकता नहीं है, कर सकते हैं और ट्रांसफ़ेक्ट तो एक बार, यह आमतौर पर एक प्लाज्मिड इलाज के लिए मुश्किल है. यह संभव पुनर्संयोजन और जीन पीटा प्रयोगों में बरकरार plasmids के उपयोग की सीमा. नकारात्मक चयन मार्करों तरीकों लक्ष्यीकरण के रूप में वे पुनः संयोजक subpopulations को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीन के प्रमुख घटक हैं. हम सफलतापूर्वक एक codon व्यक्त की है एटामोइबा हिस्टोलिटिका में FCU1 जीन अनुकूलित और एक नकारात्मक चयन मार्कर के रूप में अपनी क्षमता का परीक्षण किया. इस जीन संलयन आत्मघाती मानव ट्यूमर कोशिकाओं के जीन थेरेपी के लिए इस्तेमाल किया गया है और विषाक्त बहाव शाही सेना और डीएनए संश्लेषण 10 के निषेध में जिसके परिणामस्वरूप उत्पादों में prodrug 5-एफसी metabolizes है. FCU1 हाल ही में किया गया है प्लाज्मोडियम, एक और प्रोटोजोआ परजीवी में एक नकारात्मक चयन मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया प्लाज्मोडियम berghei FCU1 व्यक्त कोशिकाओं 5 – एफसी के साथ लगभग 1000 गुना अधिक इन विट्रो में और vivo उपचार में prodrug के प्रति संवेदनशील होना पाया गया के 99.9% से अधिक को मार डाला एरिथ्रोसाइटिक चरण 11 मलेरिया के माउस मॉडल में पुनः संयोजक परजीवी संक्रमण ई. . हिस्टोलिटिका FCU1 व्यक्त कोशिकाओं पी. में मनाया संवेदनशीलता के विपरीत में केवल एक 30 गुना वृद्धि हुई है 5 – एफसी prodrug संवेदनशीलता से पता चला है berghei. इस के लिए संभावित कारणों में वृद्धि मध्यम विषाक्त चयापचयों के साथ प्रतिस्पर्धा में उपलब्ध nucleotides के बड़े पूल हो सकता है.
दोनों पी. berghei और पी. फाल्सीपेरम FCU1 मार्कर लक्षित जीन विघटन में इस्तेमाल किया गया है. 11,12 अध्ययन. हम एटामोइबा जीनोम का उपयोग मुताबिक़ पुनर्संयोजन में हेरफेर करने के उद्देश्य. FCU1/5-FC नकारात्मक चयन प्रणाली के सत्यापन के इस लक्ष्य की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है.
The authors have nothing to disclose.
हम FCU1 जीन के अनुक्रम के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ. फिलिप erbs धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम NIH अनुदान 26649 एअर इंडिया द्वारा समर्थित किया गया था.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | ||
5-Fluorocytosine | Sigma | F7129 | ||
Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | ||
Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |