Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Modellering stroke hos möss - Middle Cerebral artärocklusion med glödlamporna modell

doi: 10.3791/2423 Published: January 6, 2011

Summary

Fintrådiga ocklusion av mellersta cerebral artär är en gemensam modell för att studera ischemisk stroke hos möss.

Abstract

Stroke är en av de vanligaste orsakerna till död och vuxna funktionshinder, särskilt i högt utvecklade länder. Men behandlingsalternativ hittills är mycket begränsade. För att möta behovet av nya terapeutiska metoder, sysselsätter experimentell stroke forskning ofta gnagarmodeller av fokal cerebral ischemi. De flesta forskare använder permanent eller övergående ocklusion av mellersta cerebral artär (MCA) hos möss eller råttor.

Proximal ocklusion av mellersta cerebral artär (MCA) via intraluminal sutur teknik (sk glödlampor eller sutur modell) är förmodligen den mest använda modellen i experimentell stroke forskning. Den intraluminal kortex modellen har den fördelen att förmå reproducerbar övergående eller kvarstående ischemi av MCA territoriet i en relativt icke-invasiv sätt. Intraluminal närmar avbryta blodflödet i hela landet av denna artär. Glödlampor ocklusion därmed arresteringar flöde proximalt om lenticulo-striate artärer, som levererar de basala ganglierna. Glödlampor ocklusion av MCA resulterar i reproducerbara skador i hjärnbarken och striatum och kan vara antingen permanent eller övergående. Däremot modeller förmå distala (till förgrening av lenticulo-striate artärer) MCA ocklusion lediga typiskt striatum och i första hand involvera neocortex. Utöver dessa modeller kräver craniectomy. I modellen visat i denna artikel är en kisel belagd glödtråd införts i den gemensamma halspulsådern och avancerade längs de inre halspulsådern i Circle of Willis, där det blockerar ursprung mitten cerebral artär. Hos patienter, ocklusioner i mitten cerebral artär är bland de vanligaste orsakerna till ischemisk stroke. Eftersom olika ischemisk mellanrum kan väljas fritt i denna modell beroende på tidpunkt för reperfusion, med varierande svårighetsgrad kan produceras ischemiska lesioner. Reperfusion genom att avlägsna de blockerade glödtråden åtminstone delvis modeller återställande av blodflödet efter spontan eller terapeutiska (TPA) lys av en tromboembolisk propp i människor.

I den här videon kommer vi att presentera den grundläggande tekniken samt de största fallgroparna och confounders som kan begränsa det prediktiva värdet för denna modell.

Protocol

För att garantera hög kvalitet och reproducerbarhet, rekommenderar vi användning av Standard Operating Procedures (SOP). I den här videon publiceras standardrutiner utvecklas och används i vårt laboratorium tillämpas. 1

1. Middle Cerebral artärocklusion

  1. Möss är nedsövd med ett lämpligt bedövningsmedel regim i samråd med veterinärpersonal. (T.ex. induktion med 1,5 - 2% Isofluran och underhåll med 1,0 - 1,5% isofluran i 2 / 3 N2O och 1 / 3 O2 med hjälp av en Vaporizer).
    1. Kroppstemperatur möss bibehålls på 36,5 ° C ± 0,5 ° C under kirurgi med en värmeplatta. En återkoppling kontrollerad uppvärmning pad, som värmer enligt den rektala temperaturen på musen, rekommenderas starkt.
    2. Desinficera huden och omgivande päls med lämpligt medel (t ex 70% etanol) och låt det torka efteråt.
  2. En mittlinjen hals snitt görs och mjukdelar dras isär.
  3. Den vänstra gemensamma halspulsådern (LCCA) är noggrant dissekeras fri från den omgivande nerver (utan att skada vagusnerven) och en ligatur görs med 6.0/7.0 strängen. 5,0 sträng kan också användas.
  4. Den vänstra yttre halspulsådern (LECA) separeras därefter och en andra knut görs.
  5. Därefter är vänster carotis interna (lica) isolerad och en knut är förberedd med en 6,0 glödtråd.
  6. Efter att ha fått en god bild av vänster carotis interna (lica) och vänster pterygopalatine artär (LPA), är båda artärer klipps med en mikrovaskulära klipp.
  7. Ett litet hål klipps i LCCA innan det bifurcates till LECA och lica. En monofilamentgarn tillverkad av 8,0 nylon belagd med silikon härdare blandning (se nedan) är sedan införs i lica, tills det tar stopp på klippet. Uppmärksamhet måste betalas inte in i skallbenet artären. (Figur 1)
  8. Den klippt artärer öppnas när glödtråden sitter i lica att täppa till ursprung LMCA i kretsen av Willis.
  9. Den tredje knut på lica är stängt för att fixera glödtråden på plats.
  10. Mössen får saltlösning 0,5 ml subkutant som volym påfyllning. För smärtlindring, är lidokain gel lokalt applicerad i såret.
  11. Om reperfusion är avsedd för, möss stanna i 30 - 90 min ocklusion i ett uppvärmt bur, kan såret stängas med en liten sutur klipp. Därefter en andra bedövning utförts, är den tredje knut på ICA momentana öppnas och glödtråden tillbaka.
  12. Resterande suturer förkortas och huden är anpassad med en kirurgisk sutur.
  13. Alla djur får en andra volym påfyllning enligt ovan.
  14. Djuren placeras i ett uppvärmt bur i två timmar för att styra för kroppstemperatur.
    1. Djuren måste kontrolleras dagligen efter operation för tecken på obehag. Mössen kunde visa några inlägg kirurgiska viktminskning. De får mosad mat i en Petri-skål på golvet för att uppmuntra att äta. Maten ersätts dagligen i sju dagar.

2. Sham Operation

  1. För bluff verksamhet glödtråden införs för att täppa LMCA och återkallade omedelbart att tillåta omedelbar reperfusion (1,8). Den efterföljande operation är identisk med den som utförs på de djur som genomgår cerebral ischemi (1,9-1,14), inklusive en andra anestesi.

3. Beredning av glödtråden

  1. Sterilitet glödtråden bör övervägas. Användningen av steriliserad utrustning samt en ändamålsenlig hantering av glödtråden är efteråt en förutsättning för en steril operation. Desinfektion av glödtråden är svårt, eftersom många av de gemensamma steriliseringsmetoder kan försämra kvaliteten på glödtråden. Men metoder såsom strålning, till exempel med UV-ljus eller strålar γ eller kemisk sterilisering, till exempel med mycket reaktiva gaser som t.ex. etylenoxid, är tillämpliga.
  2. 8,0 nylon glödtråden är skuren i längder på 11 mm under lupp
  3. Glödtråden spetsen måste vara belagda helt och jämnt över en längd av 8 mm med en härdare blandning av Xantopren M slemhinna och aktivator NF Optosil

4. Representativa resultat

Beroende på hur länge blodflödet begränsning olika motor-och beteendestörningar resultat. Både efter 30 och 60 min för cerebral ischemi, djur i de flesta fall visar minskad motståndskraft mot laterala tryck och cirklar på grund av störningar i rörelseorganen. Mildare lesioner manifesteras som en flexor position i främre liMBS. Dessa lätt observerbara tecken kan användas som ett grundläggande mål för att lyckas med operationen. 2

Morfologiskt lesionen kan bedömas med hjälp av antingen histologi eller magnetisk resonanstomografi (MRT). Sextio minuter ocklusion av mellersta cerebral artär producerar mjukpapper pannecrosis i ett område med både striatum och hjärnbarken, medan 30 minuters ischemi orsakar främst nervcellsdöd begränsad till striatum. 3 (figur 2) I fråga om infarkt volym, förväntar vi oss en standardavvikelse lägre än 30% i en uppsättning av verksamheten. Dödligheten beror på ocklusion tid med cirka 5% efter 30 minuter av ischemi och 10 - 20% efter 60 min.

En annan minimal invasiv möjlighet är att använda laser Doppler flowmetry (LDF) under operationen, som tillåter en direkt kontroll av dess framgång. I ett enskilt djur, sänkning till 10 - anger 20% av preocclusion värden klart framgångsrikt framkallande av fokal cerebral ischemi 4 kan dock LDF inte användas som en metod för interindividuell jämförelse, eftersom LDF kan bara mäta kvantitativa förändringar (i procent) av blod. flödet i en liten och begränsad vävnadsprov volym. Det ger inte information om den geografiska omfattningen av blodflödet minskning. 5

Det finns flera tester för att bedöma beteendemässiga aspekter efter stroke, inklusive gånganalys 6,7, Rotarod 8, Pole testa 9,10, lim borttagning testa 11,12, trappa testa 13,14, stege ringt testa 15,16 och Morris water maze 17. I alla dessa tester, möss utsätts för kortex utföra mindre framgångsrikt än kontroll djur.

Figur 1
Figur 1. Scheme av fartyget arkitektur som försörjer hjärnan (avbildad i bakgrunden) i musen. Olika stammar kan visa variationer, till exempel nacken artären bladen ibland från de inre halspulsådern.

Figur 2
Figur 2. Schematisk illustration av typiska lesionen storlekar efter olika tidpunkter för reperfusion i proximala kortex modell. I mitten är den typiska förlopp funktionell aktivitet och cerebralt blodflöde efter kortex avbildas. (Kortex: Middle cerebral artärocklusion, LDF: Laser Doppler flödesmätning)

Discussion

Modellen av övergående, proximal MCA ocklusion 18,19 presenteras här härmar en av de vanligaste typerna av ischemisk stroke hos patienter. 20 Baserat på variabeln reperfusion gånger, ger modellen olika grader av skador från transitorisk ischemisk attack (TIA) till stora infarkter, inklusive stora delar av ischemisk halvklotet. Detta gör forskaren för att studera olika patofysiologiska mekanismer efter stroke. 20,21

Kirurgi kan utföras på kort tid och producerar mycket reproducerbara lesioner. Trots detta kräver en noggrann kontroll av confounders. 22 Små skillnader i drift teknik kan redogöra för olika effekter på infarkt. 23,24 På grund av variationer i cerebral vaskulär anatomi, olika musstammar visar ett annat resultat. 25,26 Body Temperaturen påverkar neurologiska skador med hypotermi leda till mindre skador 27 och hypertermi att mer allvarliga underskott. 28 därför temperaturreglering och underhåll är mycket relevant i denna modell. 29 Dessutom blodtryck och gaser blod viktiga confounders av utfall och behöver skall övervakas. 30,31 Användningen av snabba och minimalt invasiva metoder (icke-invasiv blodtrycksmätning, lämplig och lätt åtkomlig blod insamlingsplatser) rekommenderas. Valet av bedövning är också mycket viktigt, eftersom vissa kan ha nervskyddande effekter och / eller vasodilatorer, som exempelvis isofluran. 32 Därför bör exponering för anestesi vara så kort som möjligt och standardiserade. Vi utesluter djur som har genomgått operation längre än 15 min.

Rakning operationsstället producerar microabrasions och inflammation och släpper hår fragment. Detta kan ytterligare öka inflammation och främja lokal infektion, som kan inverka på stroke patofysiologi. Boendeförhållanden, särskilt användningen av anrikning, kan påverka stroke resultat och bör standardiseras och som beskrivs i forskningsrapporter. 6,33,34 Användningen av miljöberikning och dess effekt på reproducerbarhet är en fråga för diskussion. 35 En annan viktig confounder är stroke orsakad risk för infektion, särskilt efter längre perioder av ischemi 36, vilket leder till ytterligare sjuklighet och ökad dödlighet. 37,38 som infektioner blir symtomatisk runt dag 3 till 5, har detta viktiga konsekvenser för långsiktig uppföljning i sådana modeller.

Ge resultat som är relevanta för utveckling av nya behandlingsstrategier för stroke, standardisering och kvalitetskontroll är mycket viktigt i preklinisk translationell strokeforskning 39 "god laboratoriesed" 40,41 mandat.:

  1. en lämplig och detaljerad beskrivning av djur som använts;
  2. urvalsstorlek beräkning och rapportering på den förväntade effekten storlek;
  3. inkludering och exkludering kriterier, inrättades före studien;
  4. randomisering av fördelningen i grupper;
  5. Fördelningen döljande i förhållande till utredarna,
  6. rapportering djur undantas från analys;
  7. blindad utvärdering av resultat;
  8. rapportering potentiella intressekonflikter och studiefinansiering.

Disclosures

Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Tyskland.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr 201.024 och nr 202.213 (European Stroke Network). Ytterligare finansiering gavs av Bundesministerium für Bildung und Forschung (Centrum för strokeforskning Berlin), och Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE).

Författarna vill tacka Mareike Thielke (Avd. för Experimental Neurology, Charité Berlin) för det stöd under operationen och Elke Ludwig (Charité Video Services) för att producera animeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical scissors (skin cut) Fine Science Tools 14028-10
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) Fine Science Tools 11253-20
Spring scissors (according to Vannas) Fine Science Tools 15000-00
Applying forceps for micro clamps Fine Science Tools 00072-14
Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) Fine Science Tools 00396-01 Also Serrefine possible
2 Hemostats according to Hartmann Fine Science Tools 13002-10
Needle holder (according Olsen-Hegar or other) Fine Science Tools 12002-14
Standard anatomical forceps (for wound closure) Fine Science Tools 11000-12
5/0 sutures Suprama for vascular ligatures
6/0 sutures Suprama for skin suture, 5/0 also possible
Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) AstraZeneca or other local pain relief
Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x Leica Zeiss MZ6 Stemi2000C
Cold light source Leica Microsystems KL1500
Temperature feedback controlled heating pad system Fine Science Tools 21052-00 With mouse pad and small probe
Anaethesia system for isoflurane
Isoflurane Abott
Veterinary Recovery Chamber Peco Services V1200 Heated cage
8.0 nylon filament Suprama TEL181005 for coating
Scalpel For cutting filament in pieces
Ruler To cut correct length of filament
Xantopren M Mucosa Heraeus Instruments
Activator Universal Plus Heraeus Instruments Optosil - Xantopren
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) Fine Science Tools 11253-20
A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments e.g. swabs, foam, …
Receptacle for new build filaments e.g. petri dish, flexible foam,…

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dirnagl, U. Members of the MCAO-SOP Group. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. (2010).
  2. Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
  3. Katchanov, J. Selective neuronal vulnerability following mild focal brain ischemia in the mouse. Brain Pathol. 13, 452-464 (2003).
  4. Dirnagl, U. Complexities, Confounders, and Challenges in Experimental Stroke Research: A checklist for researchers and reviewers in Rodent models of stroke. Dirnagl, U. Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. 267-267 (2010).
  5. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
  6. Wang, Y. A comprehensive analysis of gait impairment after experimental stroke and the therapeutic effect of environmental enrichment in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1936-1950 (2008).
  7. Lubjuhn, J. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184, 95-103 (2009).
  8. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20, 302-304 (1968).
  9. Matsuura, K., Kabuto, H., Makino, H., Ogawa, N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. J Neurosci Methods. 73, 45-48 (1997).
  10. Bouet, V. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203, 555-567 (2007).
  11. Freret, T. Delayed administration of deferoxamine reduces brain damage and promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in the rat. Eur J Neurosci. 23, 1757-1765 (2006).
  12. Modo, M. Neurological sequelae and long-term behavioural assessment of rats with transient middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 104, 99-109 (2000).
  13. Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 2-3 (1991).
  14. Baird, A. L., Meldrum, A., Dunnett, S. B. The staircase test of skilled reaching in mice. Brain Res Bull. 54, 243-250 (2001).
  15. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. J Neurosci Methods. 115, 169-179 (2002).
  16. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. J Neurosci Methods. 153, 104-113 (2006).
  17. Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11, 47-60 (1984).
  18. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  19. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  20. Endres, M., Dirnagl, U. Neuroprotective Strategies in Animal and in vitro-Models of Neuronal Damage: Ischemia and Stroke. Molecular and Cellular Biology of Neuroprotection in the CNS. Alzheimer, C. Kluver Academic and Landes Bioscience. New York. Vol. 513 455-474 (2003).
  21. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
  22. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J Exp Stroke Transl Med. 2, 2-27 (2009).
  23. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174, 18-24 (2008).
  24. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 1-2 (2003).
  25. Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44, 252-258 (2000).
  26. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  27. Florian, B. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438, 180-185 (2008).
  28. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349, 130-132 (2003).
  29. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35, 1720-1725 (2004).
  30. Shin, H. K. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39, 1548-1555 (2008).
  31. Bottiger, B. W. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65, 135-142 (1999).
  32. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
  33. Endres, M. Mechanisms of stroke protection by physical activity. Ann Neurol. 54, 582-590 (2003).
  34. Gertz, K. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99, 1132-1140 (2006).
  35. Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
  36. Liesz, A. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia: immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40, 2849-2858 (2009).
  37. Meisel, C., Schwab, J. M., Prass, K., Meisel, A., Dirnagl, U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci. 6, 775-786 (2005).
  38. Engel, O., Meisel, A. Models of Infection Before and After Stroke: Investigating New Targets. Infect Disord Drug Targets. 9, (2010).
  39. Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1465-1478 (2006).
  40. Macleod, M. R. Good laboratory practice: preventing introduction of bias at the bench. Stroke. 40, 50-52 (2009).
  41. Group, S. T. A. I. R. Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development. Stroke. 30, 2752-2758 (1999).
Modellering stroke hos möss - Middle Cerebral artärocklusion med glödlamporna modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J. Vis. Exp. (47), e2423, doi:10.3791/2423 (2011).More

Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J. Vis. Exp. (47), e2423, doi:10.3791/2423 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter