इस प्रोटोकॉल के लिए एक तेजी से प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं के cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 के स्थानान्तरण यों तकनीक का वर्णन करता है.
ग्लूकोज शरीर के लिए ऊर्जा का मुख्य स्रोत है, अपने रक्त एकाग्रता की निरंतर विनियमन की आवश्यकता है. अग्न्याशय द्वारा इंसुलिन रिलीज इंसुलिन के प्रति संवेदनशील ऊतकों, सबसे विशेष रूप से मस्तिष्क, कंकाल की मांसपेशी, और adipocytes द्वारा ग्लूकोज तेज लाती है. टाइप 2 मधुमेह और / या मोटापे से पीड़ित रोगियों को अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध के विकास और उनके ग्लूकोज homeostasis नियंत्रण करने में असमर्थ हैं. इंसुलिन प्रतिरोध के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि टाइप -2 मधुमेह के लिए नए उपचार रणनीति प्रदान कर सकता है.
ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों की भरमार परिवार 1 पूरे शरीर में तेरह विभिन्न ऊतकों पर वितरित सदस्यों के होते हैं. ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रकार 4 (GLUT4) प्रमुख ट्रांसपोर्टर है कि mediates इंसुलिन कंकाल की मांसपेशी जैसे संवेदनशील ऊतकों द्वारा ग्लूकोज तेज. इंसुलिन की अपनी रिसेप्टर के लिए बाध्य करने पर GLUT4 प्लाज्मा झिल्ली cytoplasm से सरकाना, ग्लूकोज तेज उत्प्रेरण युक्त vesicles. कम GLUT4 स्थानान्तरण टाइप 2 मधुमेह 2,3 में इंसुलिन प्रतिरोध के कारणों में से एक है .
GLUT4 के cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली स्थानान्तरण immunocytochemistry द्वारा visualized किया जा fluorophore संयुग्मित GLUT4 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं.
यहाँ, हम एक चुना अवधि के दौरान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 स्थानान्तरण की कुल मात्रा यों तकनीक का वर्णन है, प्रवाह cytometry का उपयोग. यह प्रोटोकॉल तेजी है (इंसुलिन के साथ ऊष्मायन सहित कम से कम 4 घंटे,) और के रूप में एक ही प्रयोग में 3,000 या कक्षों प्रति शर्त के रूप में कई के रूप में 1 लाख कोशिकाओं के रूप में कुछ के विश्लेषण की अनुमति देता है. यह विरोधी GLUT4 ट्रांसपोर्टर के एक बाहरी मिलान करने के लिए निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है है कि यह करने के लिए के रूप में जल्द ही के रूप में यह प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानान्तरण के बाद कोशिकी माध्यम से अवगत कराया है बाँध.
हम प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं के cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली GLUT4 के स्थानान्तरण बढ़ाता के लिए एक तेजी से तकनीक का प्रदर्शन किया है.
GLUT4 केवल transiently कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त की है और endocytosed. चूंकि बाध्य एंटीबॉडी GLUT4 के लिए endocytosis के दौरान भी संलग्न रहते हैं, प्रतिदीप्ति संकेत GLUT4 की कुल राशि है कि प्लाज्मा झिल्ली में इंसुलिन की उपस्थिति में ऊष्मायन के चुने हुए अवधि के दौरान उजागर किया गया था देता है.
इस तकनीक को भी प्लाज्मा झिल्ली के लिए एक intracellular डिब्बे से अन्य प्रोटीन के स्थानान्तरण का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता सकता है, एक अच्छा ब्याज की प्रोटीन का एक बाहरी मिलान करने के लिए निर्देशित एंटीबॉडी प्रदान उपलब्ध है. उदाहरण के लिए, एक समान परख अब सामान्यतः करने के लिए अपने प्लाज्मा 4,5 झिल्ली CD107a के स्थानान्तरण को मापने के द्वारा साइटोटोक्सिक टी lymphocytes और प्राकृतिक हत्यारा लिम्फोसाइटों के degranulation की दर का आकलन किया . सेल apoptosis या परिगलन के दौरान बाहर की ओर के लिए प्लाज्मा झिल्ली के भीतर की ओर से phosphatidylserine के स्थानान्तरण भी प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया जा सकता है, fluorophore – लेबल Annexin वी 6 का उपयोग कर.
परख की तेज़ी के अलावा, प्रवाह cytometry मिश्रित सेल आबादी में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन करने के लिए स्थानान्तरण के अध्ययन की अनुमति का लाभ प्रस्तुत करता है. वास्तव में, एक सेल सबसेट मार्करों के लिए और ब्याज की प्रोटीन, एक प्रवाह बहु लेजर 7 cytometer पर डाटा अधिग्रहण के द्वारा पीछा के लिए धुंधला हो जाना गठबंधन कर सकते हैं.
एंटीबॉडी की मात्रा प्रोटोकॉल के पैरा 1.2 में दिए गए एक प्रारंभिक बिंदु हैं, हम अनुशंसा करते हैं कि आप ब्याज की अपनी कोशिकाओं के साथ अपने एंटीबॉडी टाइट्रेट न्यूनतम एंटीबॉडी एकाग्रता है कि आप अधिकतम संकेत देता है निर्धारित है. प्राथमिक विरोधी मानव GLUT4 एंटीबॉडी हम यहां इस्तेमाल किया है के लिए एक अच्छा प्रारंभिक रेंज ट्यूब प्रति 1-10 μL (यानी प्रति 0.2-2 ट्यूब μg एंटीबॉडी), हर कोई अधिक से अधिक 1 मिलियन कोशिकाओं से युक्त ट्यूब होगा. अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के संदर्भ लें.
डेटा के सामान्यीकरण के लिए आवश्यक है के रूप में कक्षों की autofluorescence दाता दाता से करने के लिए और प्रयोग से प्रयोग करने के लिए अलग अलग होंगे.
The authors have nothing to disclose.
यह काम श्रीमती क्लिफर्ड बड़ी व्हाइट ग्राहम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था सीबी रिसर्च फंड और NIH (AR059838) संपन्न, एनआईएच (AR052791, AR044387 ARRA, NS063298) से LTT, और चिकित्सा Cytometry के Baylor कॉलेज द्वारा और NIH (NCRR S10RR024574, AI036211 NIAID और P30CA125123 NCI) से धन के साथ कोर छंटनी सेल. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 | |
Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | ||
Recombinant human insulin | Sigma | I2643 | ||
Cell lifters | VWR | 29942-118 | Cut to fit the wells | |
5 ml tubes for FACS | VWR | 60819-138 | Fit all BD machines |