Summary
Dit protocol beschrijft een snelle techniek om de translocatie van GLUT4 kwantificeren van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.
Abstract
Glucose is de belangrijkste bron van energie voor het lichaam, waarvoor een constante regulatie van de bloedconcentratie. De afgifte van insuline door de alvleesklier veroorzaakt glucose-opname door insuline-gevoelige weefsels, met name de hersenen, skeletspieren, en adipocyten. Patiënten die lijden aan type-2 diabetes en / of obesitas ontwikkelen vaak insulineresistentie en niet in staat zijn om hun glucose-homeostase te controleren. Nieuwe inzichten in de mechanismen van insulineresistentie kunnen voorzien in nieuwe behandelingsstrategieën voor type-2 diabetes.
De GLUT familie van glucose transporters bestaat uit dertien leden verdeeld over de verschillende weefsels in het hele lichaam een. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is de belangrijkste vervoerder dat bemiddelt glucose-opname door insuline gevoelige weefsels, zoals de skeletspieren. Na binding van insuline aan zijn receptor, blaasjes waarin GLUT4 uit het cytoplasma transloceren naar de plasmamembraan, het induceren van de opname van glucose. Verminderde GLUT4 translocatie is een van de oorzaken van insulineresistentie bij type-2 diabetes 2,3.
De translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar de plasma membraan kan worden gevisualiseerd door middel van immunocytochemie, met behulp van fluorofoor-geconjugeerd GLUT4-specifieke antilichamen.
Hier beschrijven we een techniek om de totale hoeveelheid GLUT4 translocatie kwantificeren van de plasmamembraan van de cellen tijdens een gekozen duur, met behulp van flow cytometrie. Dit protocol is snel (minder dan 4 uur, inclusief incubatie met insuline) en laat de analyse van zo weinig als 3000 cellen of zo veel als 1 miljoen cellen per aandoening in een enkel experiment. Zij beroept zich op anti-GLUT4 antilichamen die zijn gericht op een externe epitoop van de vervoerder die zich binden aan het zo snel als het is blootgesteld aan de extracellulaire medium na translocatie naar de plasmamembraan.
Protocol
1. Cel kleuring
- Bereid de cellen. De cellen moeten worden gebruikt terwijl nog steeds actief aan de groei (60 - 80% confluentie). Serum 's nachts verhongeren van de cellen, plaat ze cellen op 0,1 miljoen per putje in 0,5 ml serum-vrij medium in een 24-well plaat en plaats in de incubator (37 ° C, 5% CO 2) gedurende 30 min. - 2 uur om te herstellen van trypsine.
- Meng de primaire en secundaire antilichamen. Mix (5 ul van de primaire anti-GLUT4 antilichaam met een ui secundaire kip anti-geit IgG antilichaam geconjugeerd aan AlexaFluor 488) x aantal putten. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Maak een 2X werkvoorraad van insuline door verdunning van het in medium.
- Controleer of de cellen zijn toegetreden of niet.
- Voorzichtig toe te voegen 6 pi antilichaam mix en 0,5 ml van uw 2X werkvoorraad van insuline om de putjes die de cellen. Vermijd turbulentie van het medium. Incubeer (37 ° C, 5% CO 2) gedurende 30 minuten, in het donker.
- Fixeer de cellen door het toevoegen van 0,5 ml PBS + 1% PFA aan elk putje, zonder dat het schudden van de cellen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Als uw cellen gehandeld op grond van de putten, til ze met een cel lifter. Breng de cellen (1 ml totaal) in buizen die passen in uw flowcytometer en centrifuge aan pellet de cellen.
- Was de pellet tweemaal met 1 ml PBS en resuspendeer in 0,4 ml PBS + 1% PFA. Op dit punt, cellen kunnen worden verpakt in folie en opgeslagen in de koelkast (4-8 ° C) of naar de flowcytometer voor directe data-acquisitie.
2. Data Acquisition
- Stel een brede hek rondom de levende cellen in de zijwaartse verstrooiing (SSC) versus voorwaartse verstrooiing (FCS) paneel. Gebruik een negatieve buis (cellen die niet behandeld met insuline of cellen "gekleurd" met een isotype controle) om uw FL1 parameter in te stellen. Zorg ervoor dat uw piek is volledig in het paneel, niet bezuinigen op de onderkant.
- Te verwerven gegevens van ten minste 10.000 cellen per buis.
3. Data Analysis
- Teken een hek rondom het levende cellen in het SSC vs FSC-paneel (zie figuur 1A). Plot de histogrammen van AlexaFluor 488 fluorescentie-intensiteit ten opzichte van het aantal cellen in de live-cell gate (Figuur 1B). U kunt de overlay verschillende histogrammen om de verschillen te visualiseren, maar voor kwantificering, het gemiddelde en mediaan fluorescentie-intensiteit te bepalen voor elke cel populatie en het gebruik van deze nummers voor uw vergelijkingen (Figuur 1C).
- Normaliseren van de gegevens om de waarde verkregen in de afwezigheid van insuline, zoals weergegeven in figuur 1C en 1D.
4. Representatieve resultaten
In myoblasten geïsoleerd van een gezonde persoon (geen insuline resistentie), insuline induceert een dosis-afhankelijke translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar het plasmamembraan (Figuur 1, links). In tegenstelling, is insuline geen inductie van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan van myoblasten geïsoleerd uit een patiënt met insulineresistentie (Figuur 1, rechts).
Figuur 1. Voorbeeld van een kleuring experiment. Myoblasten werden geïsoleerd uit een donor zonder insulineresistentie (links) en van een patiënt met insulineresistentie (rechts). A, SSC (zijwaartse verstrooiing) versus FCS (forward scatter) grond met een hek rondom het levende cellen. B, Cellen in gated A, gekleurd met het antilichaam tegen een externe epitoop van GLUT4, en links ongestimuleerde (rood) of gestimuleerd met insuline 1 nM (blauw), 10 nM (oranje), of 100 nM (groen). Voor de figuur duidelijkheid, we geven alleen gegevens zonder en met 100 nM insuline voor de cellen met insulineresistentie. C, fluorescentie-intensiteiten (MFI) van de histogrammen weergegeven in B werden genormaliseerd tot de MFI van de cellen links ongestimuleerde (geen insuline) Mean. D, Plots van de genormaliseerde MFI gegevens van de histogrammen weergegeven in B.
Discussion
We hebben aangetoond dat een snelle techniek voor het kwantificeren van de translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.
GLUT4 is slechts tijdelijk tot uitdrukking in de plasmamembraan van cellen en is endocytosed. Omdat de gebonden antilichamen gehecht blijven aan de GLUT4, zelfs tijdens endocytose, de fluorescentie-signaal geeft de totale hoeveelheid GLUT4, dat was bij de plasmamembraan blootgesteld tijdens de gekozen duur van de incubatie in de aanwezigheid van insuline.
Deze techniek kan ook toegepast worden op het bestuderen van de translocatie van andere eiwitten uit een intracellulaire compartiment van de plasmamembraan, mits een goede antilichaam gericht op een externe epitoop van het eiwit van belang is beschikbaar. Bijvoorbeeld, is een soortgelijke test nu vaak gebruikt om de snelheid van degranulatie van cytotoxische T-lymfocyten en natural killer lymfocyten te beoordelen door het meten van de translocatie van CD107a om hun plasmamembraan 4,5. De translocatie van fosfatidylserine vanaf de binnenzijde van de plasma membraan naar de buitenzijde tijdens cel apoptose of necrose kan ook worden gedetecteerd door middel van flowcytometrie, met behulp van fluorofoor-gelabeld annexine V 6.
Naast snelheid van de test, flow cytometrie presenteert het voordeel dat de studie van proteïne translocatie naar de plasmamembraan in gemengde celpopulaties. Inderdaad, kan men combineren kleuring voor cel subset markers en voor het eiwit van belang, gevolgd door de data-acquisitie op een multi-laser flowcytometer 7.
De bedragen van antilichamen in paragraaf 1.2 van het protocol zijn een uitgangspunt, raden wij u aan uw antistoffen titreer met je cellen van belang zijn voor de minimum antilichaamconcentratie dat geeft je een maximale signaal te bepalen. Een goed uitgangspunt bereik van de primaire anti-humane antilichaam GLUT4 we hier hebben gebruikt zou 10 tot 10 pi per buis (dat wil zeggen 0,2-2 ug antilichaam per tube), elke buis met niet meer dan 1 miljoen cellen zijn. Voor andere primaire antilichamen, de instructies van de leverancier.
Normalisatie van gegevens is noodzakelijk als autofluorescentie van de cellen zal variëren van donor tot donor en van experiment om te experimenteren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de mevrouw Clifford Elder White Graham Bijzonder Onderzoeksfonds en het NIH (AR059838) naar CB, van de NIH (AR052791, AR044387-ARRA, & NS063298) om LTT, en door het Baylor College of Medicine Cytometry en Cell Sorting Core met financiële steun van de NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, en NCI P30CA125123). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
