Summary
Этот протокол описывает быстрый метод количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.
Abstract
Глюкоза является основным источником энергии для организма, требующий постоянного регулирования его концентрацию в крови. Высвобождение инсулина в поджелудочной железе вызывает потребление глюкозы по инсулин-чувствительных тканей, в первую очередь мозг, скелетные мышцы и адипоциты. Пациенты, страдающие от 2-го типа диабета и / или ожирение часто развивается резистентность к инсулину и не в состоянии контролировать свои гомеостаз глюкозы. Новое понимание механизмов резистентности к инсулину может предоставить новые стратегии лечения для 2-го типа сахарного диабета.
GLUT семейства глюкозы перевозчиков состоит из тринадцати членов, распределенных на разных тканях по всему телу 1. Глюкоза транспортер типа 4 (GLUT4) является основным транспортером, который служит посредником глюкозы к инсулину чувствительные ткани, например, скелетных мышцах. После связывания инсулина со своим рецептором, пузырьки, содержащие GLUT4 перемещать из цитоплазмы в плазматическую мембрану, вызывая глюкозы. Уменьшение GLUT4 транслокации является одной из причин инсулинорезистентности у 2-го типа диабета 2,3.
Транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану могут быть визуализированы на иммуноцитохимии, используя флуорофора-сопряженных GLUT4-специфических антител.
Здесь мы опишем метод количественного общей суммы GLUT4 транслокации к плазматической мембраны клеток при выбранной длительности, с помощью проточной цитометрии. Этот протокол является быстрое (менее 4 часов, в том числе инкубации с инсулином) и позволяет проводить анализ всего лишь 3000 клеток или почти 1 млн. клеток на состояние в одном эксперименте. Он опирается на анти-GLUT4 антитела, направленные на внешний эпитопу транспортер, которые связывают с его, как только он был открыт для внеклеточной среде после транслокации в плазматическую мембрану.
Protocol
1. Сотовые Окрашивание
- Подготовка клетки. Клетки должны быть использованы в то же время активно развивается (60 - 80% слияния). Сыворотка голодать клетки на ночь, пластинка их клетки на уровне 0,1 млн. долл. и в 0,5 мл бессывороточной среде в 24-луночного планшета и поместите в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2) в течение 30 минут - 2 часа, чтобы восстановить от трипсинизации.
- Смешайте первичного и вторичного антитела. Mix (5 мкл первичных анти-GLUT4 антитела с 1 мкл вторичных куриные анти-IgG антител козы конъюгированных с AlexaFluor 488) х количество скважин. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, в темноте.
- Подготовка 2X рабочий запас инсулина путем разбавления ее в среду.
- Убедитесь, что клетки присоединились или нет.
- Аккуратно добавить 6 мкл смеси антител и 0,5 мл 2 раза ваш рабочий запас инсулина для скважин содержащих клеток. Избегайте любой турбулентности среды. Инкубируйте (37 ° C, 5% СО 2) в течение 30 минут, в темноте.
- Fix клетки, добавляя 0,5 мл ФСБ + 1% PFA в каждую лунку, без встряхивания клеток. Инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, в темноте.
- Если ваши клетки придерживаются скважин, слегка приподнимите их ячейки Колмар. Передача клетки (1 мл общего числа) в пробирки, которые вписываются в ваш проточный цитометр и центрифуга для осаждения клеток.
- Вымойте гранул в два раза с 1 мл PBS и ресуспендируют в 0,4 мл PBS + 1% PFA. В этот момент клетки могут быть завернуты в фольгу и хранить в холодильнике (4-8 ° С) или приняты для потока цитометр для немедленного сбора данных.
2. Сбор данных
- Установить широкие ворота вокруг живых клеток в сторону рассеяния (SSC) по сравнению с разбросом вперед (ФТС) панели. Используйте отрицательные трубки (клетки не получавших инсулин или ячейки "окрашенные" с изотипа управления), чтобы установить параметр FL1. Убедитесь, что пик полностью на панели, а не заключать на нижней стороне.
- Получения данных, по крайней мере 10 000 клеток на трубе.
3. Анализ данных
- Нарисуйте ворот вокруг живых клеток в SSC против ФСБ панели (рис. 1А). Участок гистограммы AlexaFluor 488 интенсивности флуоресценции от числа клеток в живых-клеток ворот (рис. 1В). Можно наложить различные гистограммы для визуализации различий, но для количественного, определить среднее и медиана интенсивности флуоресценции для каждой ячейки населения и использовать эти номера для Вашего сравнения (рис. 1в).
- Нормализация данных значения, полученные в отсутствие инсулина, как показано на рисунках 1C и 1D.
4. Представитель Результаты
В миобластов изолированы от здорового человека (без резистентности к инсулину), инсулин вызывает дозозависимое транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану (рис. 1, слева). В отличие от этого, инсулин не вызывает GLUT4 транслокации к плазматической мембране миобластов изолированы от больных с резистентностью к инсулину (рис. 1, справа).
Рисунок 1. Пример окрашивания эксперимента. Миобластов были изолированы от донора без резистентности к инсулину (слева) и от пациентов с резистентностью к инсулину (справа)., SSC (боковой разброс) по сравнению с FCS (вперед разброс) сюжет с воротами вокруг живых клеток. B, клетки в закрытом , окрашивали антителами против внешних эпитопу GLUT4, и оставил нестимулированных (красный) или стимулированный инсулином 1 нм (синий), 10 нм (оранжевый), или 100 нм (зеленый). Для фигуры ясности, мы показываем только данных без и с 100 нМ инсулина для клеток с резистентностью к инсулину. C, средняя интенсивность флуоресценции (МФО) из гистограммы показаны на В были нормированы на МФО клеток левой нестимулированных (без инсулина). D, Земельные нормализованные данные МФО из гистограммы показан на B.
Discussion
Мы продемонстрировали быстрый метод для количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.
GLUT4 только временно, высказанные на плазматической мембране клеток и эндоцитарных. Так связанных антител остаются прикрепленными к GLUT4, даже во время эндоцитоза, сигнал флуоресценции дает общую сумму GLUT4, что подвергался в плазматической мембране при выбранной длительности инкубации в присутствии инсулина.
Этот метод может быть применен и к изучению перемещения других белков из внутриклеточных отсека мембране, при условии хорошей антитела, направленные на внешний эпитопу белка интерес имеется. Например, подобный анализ в настоящее время широко используется для оценки скорости дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных лимфоцитов убийца, измеряя перемещение CD107a их плазматической мембраны 4,5. Транслокации фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на внешней стороне во время апоптоз или некроз также могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, используя флуорофора меченных Аннексин V 6.
Кроме быстроты анализа, проточная цитометрия представляет преимущество, что позволяет изучение белков транслокации в плазматическую мембрану в смешанных популяциях клеток. В самом деле, можно объединить окрашивание на маркеры ячейки подмножество и для белок, а затем сбор данных на нескольких лазерных потока цитометр 7.
Количество антител, указанные в пункте 1.2 протокола отправной точкой, мы рекомендуем вам титровать ваших антител с клетками, представляющие интерес для определения минимальной концентрации антител, который дает вам максимальный сигнал. Хорошая отправная диапазон для первичного анти-человеческий GLUT4 антител мы использовали здесь будет 1-10 мкл на трубке (т.е. 0,2-2 мкг антител на трубке), каждый из трубки, содержащей не более чем на 1 млн. клеток. Для других первичных антител, обратитесь к инструкциям поставщика.
Нормализация данных необходима как флуоресценции клеток будет варьироваться от донора к донора и от эксперимента к эксперименту.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от миссис Клиффорд старейшина Белый Грэм Наделенный Fund Research & NIH (AR059838) для ЦБ, из NIH (AR052791, AR044387-ARRA, и NS063298), чтобы LTT, а также колледжа Бэйлора цитометрии медицины и клеточной сортировки основной при финансировании со стороны NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, и NCI P30CA125123). Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 |
| Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Recombinant human insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Cell lifters | VWR international | 29942-118 | Cut to fit the wells |
| 5 ml tubes for FACS | VWR international | 60819-138 | Fit all BD machines |
References
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
