이 프로토콜은 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 수치 빠른 방법을 설명합니다.
포도당은 혈액 농도의 지속적인 규제를 요구, 신체 에너지의 주요 원천입니다. 췌장에서 인슐린 릴리스는 인슐린에 민감한 조직, 특히 뇌, 골격근, 그리고 adipocytes에 의해 포도당 이해를 유도. 타입 2 당뇨병 및 / 또는 비만의 고통 환자는 종종 인슐린 저항을 개발하고 그들의 포도당 항상성를 제어하는 수 없습니다. 인슐린 저항의 메커니즘에 새로운 통찰력은 유형 2 당뇨병에 대한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다.
포도당 전송기의 GLUT 가족은 신체 전반에 걸쳐 하나 다른 조직에 분산 열세 명의 회원으로 구성되어 있습니다. 포도당 수송 유형 4 (GLUT4)는 주요 전송기는 같은 골격근과 같은 인슐린에 민감한 조직에 의해 mediates 포도당 이해되는. 의 수용체에 인슐린의 결합되면, GLUT4는 포도당 이해를 유도, 플라즈마 막으로 세포질에서 이동시키다 포함 vesicles. 감소 GLUT4 translocation 형 – 2 당뇨병 2,3에서 인슐린 저항의 원인 중 하나입니다.
세포질에서 플라즈마 막에 GLUT4의 translocation이 형광단 – 복합 GLUT4 특정 항체를 사용, immunocytochemistry에 의해 시각하실 수 있습니다.
여기, 우리는 유동세포계측법를 사용하여 선택한 기간 동안 세포의 플라즈마 막에 GLUT4 translocation 총 금액을 수치 기법을 설명합니다. 이 프로토콜은 빠른 속도이다 (인슐린과 부화를 포함한 미만 4 시간)과 하나의 실험에서 3000 셀 또는 조건마다 많은 백만으로 세포 같이 몇 가지의 분석을 수 있습니다. 그것은 전송기의 외부 에피토프로 이동 방지 GLUT4 항체에 의존되는 즉시이 플라즈마 막에 translocation 후 세포 매체 노출로에 바인딩.
우리는 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 quantifying에 대한 신속한 기술을 증명하고있다.
GLUT4는 transiently 세포의 플라즈마 막에서 표현하고 endocytosed입니다. 바운드 항체도 endocytosis 동안 GLUT4에 연결된 상태 때문에, 형광 신호가 인슐린의 존재에 부화의 선택한 기간 동안 플라즈마 막에 노출되었다 GLUT4의 총 금액을 제공합니다.
이 기술은 또한, 플라즈마 막에 세포내 구획에서 다른 단백질의 translocation을 연구에 적용할 관심의 단백질의 외부 에피토프로 이동 좋은 항체 사용할 수 있습니다 제공될 수 있습니다. 예를 들어, 비슷한 분석은 이제 일반적으로 4,5 자신의 플라즈마 막에 CD107a의 translocation을 측정하여 세포 독성 T의 lymphocytes 자연 킬러 lymphocytes의 degranulation의 속도를 평가하는 데 사용됩니다. 세포 apoptosis 또는 괴사 동안 바깥쪽으로 플라즈마 막의 안쪽에서 phosphatidylserine의 translocation도 형광단 – 라벨 Annexin V 6을 사용, 유동세포계측법에 의해 감지하실 수 있습니다.
분석의 인텔리 게다가, 유동세포계측법 혼합 세포 집단에서 플라즈마 막에 단백질 translocation 연구를 허용 장점을 제공합니다. 사실, 하나는 세포 집합 표시 및 멀티 레이저 흐름 cytometer 7 데이터 수집 다음 관심의 단백질에 대한 얼룩을 결합할 수 있습니다.
프로토콜의 단락 1.2 주어진 항체의 금액은 출발점되며 우리는 당신이 당신에게 최대 신호를 제공하는 최소 항체 농도를 결정하기 위해 관심의 세포와 항체를 적정하다하는 것이 좋습니다. 우리가 사용한 주요 안티 – 인간 GLUT4 항체에 대한 좋은 시작 범위 튜브 당 1-10 μL (튜브 당 즉 0.2-2 μg 항체), 더 이상 백만 이상의 세포를 포함하는 각각의 튜브 것입니다. 다른 차 항체 들어, 공급 업체의 지침을 참조하십시오.
세포의 autofluorescence은 기증자로부터 기증하고 실험에서 실험을 다양하므로 데이터의 정상화가 필요합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 부인의 클리포드 엘더 화이트 그레이엄의 보조금에 의해 지원되었다 LTT하는 NIH (AR052791, AR044387 – 아라, & NS063298)에서, CB 연구 기금 & NIH (AR059838)를 둘러 싸인하고, 의학 Cytometry의 베일러 대학에서 NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, & NCI P30CA125123)에서 자금 코어 정렬과 셀. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 | |
Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | ||
Recombinant human insulin | Sigma | I2643 | ||
Cell lifters | VWR | 29942-118 | Cut to fit the wells | |
5 ml tubes for FACS | VWR | 60819-138 | Fit all BD machines |