Detta protokoll beskriver en snabb teknik för att kvantifiera på flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet av celler med flödescytometri.
Glukos är den främsta källan till energi för kroppen, kräver ständig reglering av dess blodkoncentration. Insulinfrisättning i bukspottkörteln inducerar glukos upptag av insulin-känsliga vävnader, främst hjärnan, skelettmuskel och adipocyter. Patienter som lider av typ-2 diabetes och / eller övervikt ofta utveckla insulinresistens och inte kan kontrollera sina glukoshomeostas. Nya insikter om mekanismerna bakom insulinresistens kan ge nya behandlingsstrategier för typ 2-diabetes.
Den GLUT familj glukos transportörer består av tretton medlemmar fördelat på olika vävnader i hela kroppen 1. Glukos transportör typ 4 (GLUT4) är den största transportören som förmedlar glukosupptag av insulin känsliga vävnader såsom skelettmuskulatur. När insulin binds till sin receptor, blåsor innehåller GLUT4 translocate från cytoplasman till plasmamembranet, förmå glukosupptag. Minskad GLUT4 translokation är en av orsakerna till insulinresistens i typ-2 diabetes 2,3.
Flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet kan visualiseras genom immuncytokemi, med hjälp av fluoroforen-konjugerad GLUT4-specifika antikroppar.
Här beskriver vi en teknik för att kvantifiera det totala belopp av GLUT4 translokation till plasmamembranet av celler under en vald tid, med hjälp av flödescytometri. Detta protokoll är snabb (mindre än 4 timmar, inklusive inkubation med insulin) och kan analys av så få som 3000 celler eller så många som 1 miljon celler per tillstånd i ett enda experiment. Den bygger på anti-GLUT4 antikroppar riktade till en extern epitop av transportören som binder till den så snart som det är utsatt till den extracellulära mediet efter translokation till plasmamembranet.
Vi har visat en snabb teknik för att kvantifiera på flyttning av GLUT4 från cytoplasman till plasmamembranet av celler med flödescytometri.
GLUT4 är bara tillfälligt uttryckt i membranet på celler och är endocyteras. Eftersom de bundna antikropparna finns kvar på den GLUT4, även under endocytos, ger fluorescenssignalen den totala GLUT4 som var utsatt till plasmamembranet under den valda varaktigheten av inkubation i närvaro av insulin.
Denna teknik kan också användas för att studera på flyttning av andra proteiner från en intracellulär facket till plasmamembranet, gav en bra antikropp riktad mot en extern epitop av proteinet av intresse är tillgänglig. Till exempel är en liknande assay nu allmänt används för att bedöma graden av degranulering av cytotoxiska T-lymfocyter och naturliga lymfocyter mördare genom att mäta på flyttning av CD107a deras plasma membrane 4,5. Flyttning av fosfatidylserin från insidan av plasmamembranet till den yttre sidan under apoptos eller nekros kan också upptäckas med flödescytometri, med hjälp av fluoroforen-märkt Annexin V 6.
Förutom snabbheten i analysen presenterar flödescytometri den fördelen att studiet av protein translokation till plasmamembranet i blandade cellpopulationer. I själva verket kan man kombinera färgning för markörer cell delmängden och för proteinet av intresse, följt av datainsamling på en multi-laser flödescytometer 7.
De belopp av antikroppar som anges i punkt 1.2 i protokollet är en utgångspunkt, vi rekommenderar att du titrera dina antikroppar med dina celler av intresse att bestämma den lägsta koncentrationen av antikroppar som ger dig en maximal signal. En bra start sortiment för den primära anti-human GLUT4 antikropp har vi använt här skulle vara 10-10 mikroliter per rör (dvs 0,2-2 mikrogram antikropp per rör), varje rör som inte innehåller mer än 1 miljon celler. För andra primära antikroppar, se leverantörens anvisningar.
Normalisering av data är nödvändig som autofluorescens av celler kommer att variera från givare till givare och från experiment till experiment.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Mrs Clifford Elder Vit Graham Begåvad Research Fund och NIH (AR059838) till CB, från NIH (AR052791, AR044387-Arra, & NS063298) till LTT och av Baylor College of Medicine Cytometry och Cell Sortering Core med finansiering från NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, & NCI P30CA125123). Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Anti-human GLUT4 antibodies | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1606 | Against an external epitope of GLUT4 | |
Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | ||
Recombinant human insulin | Sigma | I2643 | ||
Cell lifters | VWR | 29942-118 | Cut to fit the wells | |
5 ml tubes for FACS | VWR | 60819-138 | Fit all BD machines |