Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

doi: 10.3791/2429 Published: November 7, 2010

Summary

Этот протокол описывает быстрый метод количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.

Abstract

Глюкоза является основным источником энергии для организма, требующий постоянного регулирования его концентрацию в крови. Высвобождение инсулина в поджелудочной железе вызывает потребление глюкозы по инсулин-чувствительных тканей, в первую очередь мозг, скелетные мышцы и адипоциты. Пациенты, страдающие от 2-го типа диабета и / или ожирение часто развивается резистентность к инсулину и не в состоянии контролировать свои гомеостаз глюкозы. Новое понимание механизмов резистентности к инсулину может предоставить новые стратегии лечения для 2-го типа сахарного диабета.

GLUT семейства глюкозы перевозчиков состоит из тринадцати членов, распределенных на разных тканях по всему телу 1. Глюкоза транспортер типа 4 (GLUT4) является основным транспортером, который служит посредником глюкозы к инсулину чувствительные ткани, например, скелетных мышцах. После связывания инсулина со своим рецептором, пузырьки, содержащие GLUT4 перемещать из цитоплазмы в плазматическую мембрану, вызывая глюкозы. Уменьшение GLUT4 транслокации является одной из причин инсулинорезистентности у 2-го типа диабета 2,3.

Транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану могут быть визуализированы на иммуноцитохимии, используя флуорофора-сопряженных GLUT4-специфических антител.

Здесь мы опишем метод количественного общей суммы GLUT4 транслокации к плазматической мембраны клеток при выбранной длительности, с помощью проточной цитометрии. Этот протокол является быстрое (менее 4 часов, в том числе инкубации с инсулином) и позволяет проводить анализ всего лишь 3000 клеток или почти 1 млн. клеток на состояние в одном эксперименте. Он опирается на анти-GLUT4 антитела, направленные на внешний эпитопу транспортер, которые связывают с его, как только он был открыт для внеклеточной среде после транслокации в плазматическую мембрану.

Protocol

1. Сотовые Окрашивание

  1. Подготовка клетки. Клетки должны быть использованы в то же время активно развивается (60 - 80% слияния). Сыворотка голодать клетки на ночь, пластинка их клетки на уровне 0,1 млн. долл. и в 0,5 мл бессывороточной среде в 24-луночного планшета и поместите в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2) в течение 30 минут - 2 часа, чтобы восстановить от трипсинизации.
  2. Смешайте первичного и вторичного антитела. Mix (5 мкл первичных анти-GLUT4 антитела с 1 мкл вторичных куриные анти-IgG антител козы конъюгированных с AlexaFluor 488) х количество скважин. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, в темноте.
  3. Подготовка 2X рабочий запас инсулина путем разбавления ее в среду.
  4. Убедитесь, что клетки присоединились или нет.
  5. Аккуратно добавить 6 мкл смеси антител и 0,5 мл 2 раза ваш рабочий запас инсулина для скважин содержащих клеток. Избегайте любой турбулентности среды. Инкубируйте (37 ° C, 5% СО 2) в течение 30 минут, в темноте.
  6. Fix клетки, добавляя 0,5 мл ФСБ + 1% PFA в каждую лунку, без встряхивания клеток. Инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, в темноте.
  7. Если ваши клетки придерживаются скважин, слегка приподнимите их ячейки Колмар. Передача клетки (1 мл общего числа) в пробирки, которые вписываются в ваш проточный цитометр и центрифуга для осаждения клеток.
  8. Вымойте гранул в два раза с 1 мл PBS и ресуспендируют в 0,4 мл PBS + 1% PFA. В этот момент клетки могут быть завернуты в фольгу и хранить в холодильнике (4-8 ° С) или приняты для потока цитометр для немедленного сбора данных.

2. Сбор данных

  1. Установить широкие ворота вокруг живых клеток в сторону рассеяния (SSC) по сравнению с разбросом вперед (ФТС) панели. Используйте отрицательные трубки (клетки не получавших инсулин или ячейки "окрашенные" с изотипа управления), чтобы установить параметр FL1. Убедитесь, что пик полностью на панели, а не заключать на нижней стороне.
  2. Получения данных, по крайней мере 10 000 клеток на трубе.

3. Анализ данных

  1. Нарисуйте ворот вокруг живых клеток в SSC против ФСБ панели (рис. 1А). Участок гистограммы AlexaFluor 488 интенсивности флуоресценции от числа клеток в живых-клеток ворот (рис. 1В). Можно наложить различные гистограммы для визуализации различий, но для количественного, определить среднее и медиана интенсивности флуоресценции для каждой ячейки населения и использовать эти номера для Вашего сравнения (рис. 1в).
  2. Нормализация данных значения, полученные в отсутствие инсулина, как показано на рисунках 1C и 1D.

4. Представитель Результаты

В миобластов изолированы от здорового человека (без резистентности к инсулину), инсулин вызывает дозозависимое транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану (рис. 1, слева). В отличие от этого, инсулин не вызывает GLUT4 транслокации к плазматической мембране миобластов изолированы от больных с резистентностью к инсулину (рис. 1, справа).

Рисунок 1
Рисунок 1. Пример окрашивания эксперимента. Миобластов были изолированы от донора без резистентности к инсулину (слева) и от пациентов с резистентностью к инсулину (справа)., SSC (боковой разброс) по сравнению с FCS (вперед разброс) сюжет с воротами вокруг живых клеток. B, клетки в закрытом , окрашивали антителами против внешних эпитопу GLUT4, и оставил нестимулированных (красный) или стимулированный инсулином 1 нм (синий), 10 нм (оранжевый), или 100 нм (зеленый). Для фигуры ясности, мы показываем только данных без и с 100 нМ инсулина для клеток с резистентностью к инсулину. C, средняя интенсивность флуоресценции (МФО) из гистограммы показаны на В были нормированы на МФО клеток левой нестимулированных (без инсулина). D, Земельные нормализованные данные МФО из гистограммы показан на B.

Discussion

Мы продемонстрировали быстрый метод для количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.

GLUT4 только временно, высказанные на плазматической мембране клеток и эндоцитарных. Так связанных антител остаются прикрепленными к GLUT4, даже во время эндоцитоза, сигнал флуоресценции дает общую сумму GLUT4, что подвергался в плазматической мембране при выбранной длительности инкубации в присутствии инсулина.

Этот метод может быть применен и к изучению перемещения других белков из внутриклеточных отсека мембране, при условии хорошей антитела, направленные на внешний эпитопу белка интерес имеется. Например, подобный анализ в настоящее время широко используется для оценки скорости дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных лимфоцитов убийца, измеряя перемещение CD107a их плазматической мембраны 4,5. Транслокации фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на внешней стороне во время апоптоз или некроз также могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, используя флуорофора меченных Аннексин V 6.

Кроме быстроты анализа, проточная цитометрия представляет преимущество, что позволяет изучение белков транслокации в плазматическую мембрану в смешанных популяциях клеток. В самом деле, можно объединить окрашивание на маркеры ячейки подмножество и для белок, а затем сбор данных на нескольких лазерных потока цитометр 7.

Количество антител, указанные в пункте 1.2 протокола отправной точкой, мы рекомендуем вам титровать ваших антител с клетками, представляющие интерес для определения минимальной концентрации антител, который дает вам максимальный сигнал. Хорошая отправная диапазон для первичного анти-человеческий GLUT4 антител мы использовали здесь будет 1-10 мкл на трубке (т.е. 0,2-2 мкг антител на трубке), каждый из трубки, содержащей не более чем на 1 млн. клеток. Для других первичных антител, обратитесь к инструкциям поставщика.

Нормализация данных необходима как флуоресценции клеток будет варьироваться от донора к донора и от эксперимента к эксперименту.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от миссис Клиффорд старейшина Белый Грэм Наделенный Fund Research & NIH (AR059838) для ЦБ, из NIH (AR052791, AR044387-ARRA, и NS063298), чтобы LTT, а также колледжа Бэйлора цитометрии медицины и клеточной сортировки основной при финансировании со стороны NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, и NCI P30CA125123). Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human GLUT4 antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-1606 Against an external epitope of GLUT4
Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 Invitrogen A-21467
Recombinant human insulin Sigma-Aldrich I2643
Cell lifters VWR international 29942-118 Cut to fit the wells
5 ml tubes for FACS VWR international 60819-138 Fit all BD machines

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
  2. Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
  3. Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
  4. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
  5. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
  6. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429, doi:10.3791/2429 (2010).More

Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429, doi:10.3791/2429 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter