Summary
Yetişkin fare hipotalamik suprakiazmatik nükleus (SCN) ve kültür ile hızlı bir şekilde Organotipik kültür durumda SCN doku içeren dilimleri, hazırlama prosedürü rapor edilmiştir. Ayrıca, salınım saat gen protein ekspresyonu dinamik lusiferaz muhabiri teknolojisini kullanarak ölçüm açıklanmıştır.
Abstract
Fizyoloji ve davranış günlük ritimlerin koordinasyon merkezi bir sirkadiyen (24 saat) saat anterior hipotalamusta bulunan suprakiazmatik nükleus (SCN) bulunur. Saat doğrudan ışık retina ve optik sinir vasıtasıyla senkronize edilir. Sirkadiyen salınımlar negatif geri besleme döngüleri etkileşim Dönem (Kişi) genler de dahil olmak üzere, sözde "saat genleri" ve bunların protein ürünleri, bir dizi oluşturulur . Çekirdek saat membran depolarizasyon, kalsiyum ve cAMP 1 bağlıdır. SCN saat gen ekspresyonu, metabolik aktivite ve spontan elektriksel aktivite günlük salınımlar gösterir. Enteresandır ki, bu endojen siklik aktivite SCN 2-4 yetişkin doku dilimler halinde devam etmektedir. Bu şekilde, biyolojik saat, pacemaker fonksiyonunun moleküler, elektrofizyolojik ve metabolik incelemeler izin in vitro okudu olabilir .
SCN optik kiazma 5 sağ üstünde yer alan küçük, iyi tanımlanmış ikili yapı. Sıçan her çekirdeğinde ~ 8.000 nöron içeren ve yaklaşık 947 mm (uzunluk, rostro ekseni) x 424 mm (genişlik) x 390 mm (yükseklik) 6 boyutlara sahip. SCN tespit edilebilir beynin belirli bir düzeyde bir beyin dilim kesmek için gerekli olan SCN incelemek. Burada, fare ve sıçan beyinlerinde benzer SCN, diseksiyon ve dilimleme prosedürü açıklar. Ayrıca, biz nasıl bir zar 7, Yamazaki ve ark SCN doku kültürü için geliştirilmiş bir tekniktir organotypically disseke doku kültürü göstermektedir. 8. Son olarak, transgenik dokusu, dinamik lusiferaz muhabiri teknoloji, başlangıçta Geusz ve ark sirkadiyen ölçümler için kullanılan bir yöntem. 9 saat genler / proteinler ifade ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir . Biz burada transgenik SCN dokuları kullanmak PERIOD2-vurmak: Yoo ve ark tarafından üretilen Lusiferaz fareler 10. Fareler DÖNEM bir füzyon proteini (PER) 2 ve ateşböceği enzim Lusiferaz içerir. Lusiferaz luciferase oksidasyonunu katalize zaman PER2 lucifeares, yani luciferase substrat varlığında tercüme edilir, PER2 ifade biyoparlaklık olarak takip edilebilir. Fotonların sayısını olumlu üretilen PER2 protein miktarı ile ilişkilidir ve biyoparlaklık ritimleri, in vivo 10 PER2 protein ritim maç . Bu şekilde PER2 ifade siklik değişkenlik birçok gün boyunca sürekli gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Doku kültür ve gerçek zamanlı biyoparlaklık kayıt için takip protokolü Yamazaki ve Takahashi 11 tarafından iyice tarif edilmiştir.
Protocol
1. Solüsyon hazırlama
- Hava-tamponlama kapasitesi ile Kültür orta
- 1 litrelik şişe yaklaşık 800 ml steril H 2 O (otoklava milliQ H 2 O) ile doldurun.
- Karıştırarak iken, ekleyebilir ve aşağıdaki maddelerin karışımı: 1 konteyner düşük glukoz, sodyum bikarbonat ve olmayan serum DMEM 2902 toz fenol kırmızısı (fenol kırmızısı biyoparlaklık sinyali engelleyen), 20 ml B27 takviyesi 50x, 4.7 mL% 7.5 NaHCO 3 solüsyonu (veya 0.35 g NaHCO 3), 10 ml Hepes 1M, 2.5 ml PenStrep 10.000 U / mL ve 3.5 g D-glukoz. Orta malzemeler tamamen eriyene kadar karıştırın edelim.
Final orta (1 litre) içerecektir:
1x DMEM, 1x B27 takviyesi, 4.2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml penisilin, 25 U / ml streptomisin ve 19 mM D-glukoz. - NaOH azaltmak veya HCl pH değerinin yükseltilmesini ve steril H 2 O. ile 1 litre hacim getirmek için kullanarak, pH 7.2 'ye ayarlayın.
- H 2 O (azalma osmolalitesi) veya D-glukoz (artış osmolalitesi) ile osmolalitesi ayarlayın. Osmolalitesi 285-315 mOsm / Kg arasında olmalıdır ama en uygun aralığı 300-310 mOsm / Kg 'dır. % 5 daha fazla orta sulandırmak için.
- Filtre, steril bir kaput Corning steril vakumlu filtrasyon setleri (örneğin 2 x 500 ml 0,22 mikron gözenek boyutu) kullanarak kültür ortamı. 4 ° C orta tutun ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan korumak. Biz orta 3 ay içinde kullanılır öneririz.
- Hank takviyeleri ile dengeli tuz solüsyonu (HBSS) tampon (kesim dilim için)
- ~ 600 mL steril (otoklava milliQ) H 2 O ile 1 litrelik cam şişe doldurun ve aşağıdaki maddeler: 100 mL HBSS 10x hisse senedi, 10 ml Penisilin-Streptomisin 10.000 U / ml, 5 ml ve% 7.5 NaHCO 3 çözümü 10 ml 1M Hepes.
Son kesim çözüm içerecektir:
1x HBSS, 10 mM HEPES, 4.5 mM NaHCO 3, 100 U / ml penisilin ve 100 U / ml streptomisin. - PH kontrol edin ve gerekirse pH 7.2 'ye ayarlamak ve steril H 2 O. ile 1 litre hacimli getirmek
- 285-315 mOsm / Kg arasında olması gereken, ozmolalite kontrol edin.
- 4 ° C'ye kadar HBSS soğutun HBSS tampon dilimleme / metabolizma aşağı getirmek ve doku canlılığı korumak için kesme işlemi sırasında çok soğuk (4 ° C) olması gerekir.
- ~ 600 mL steril (otoklava milliQ) H 2 O ile 1 litrelik cam şişe doldurun ve aşağıdaki maddeler: 100 mL HBSS 10x hisse senedi, 10 ml Penisilin-Streptomisin 10.000 U / ml, 5 ml ve% 7.5 NaHCO 3 çözümü 10 ml 1M Hepes.
2. Kesme ve Kültürleme Dilimler önce hazırlıklar
- Dokularda CO 2 olmadan sıcak ve kuru odasında kültür . Kültürler kurumasını önlemek için gres yemekleri kapak camları ile mühürlenmiş olması gerekir. Bu amaçla, silikon bazlı vakum gres ile 5 ml şırınga doldurun. Şırınga uçları küçük bir parça alüminyum folyo ile örtün ve otoklavda. Ayrıca, otoklav filtre kağıtları (dilimleme işlem sırasında kullanılan).
- Sağ prosedürü dilimleme önce, 35 mm petri kutularının üst halka yüzeyinde otoklavlanmış vakum gres sürün. Her bir dilim kültür için ayrı bir petri hazırlayın.
- Prosedürü tüm steril olmayan aletler dilimleme başlamadan önce, tıraş bıçakları, vibratome bıçaklar, kapak camları ve diğer malzemelerin sterilize edilecek dilim ve kültür prosedürü için kullanılır. % 70 etanol ile tüm steril olmayan aletlerle püskürtün. Kültür önce en az 30 dakika UV ışınlarına maruz kalma, UV ile steril bir kaput aletler ve yağlanmış petri kaplarına Açığa.
- Aynı zamanda, hava-tamponlama kültür vasatı (her kültür için 1.2 ml saymak; 8 kültürler Örneğin 10 ml orta hazırlamak için) ile Falcon tüp doldurmak ve taze çözülmüş luciferase (0.1 M stok solüsyonu; Promega, Madison, WI) eklemek (10 mcL luciferase 10 ml orta, son konsantrasyonu 0.1 mM).
- Luciferase ışığa duyarlı ve stok çözümleri ve luciferase içeren orta ışıktan korunması gereken. Karanlık bir 36-37 ° C ısıtma odalı luciferase orta Falcon tüp yerleştirin. Eğer uygunsa, luciferase aynı zamanda kesme zamanda kültür kaplarına doğrudan eklenebilir. Luciferase eklendi değilse, lusiferaz ve luciferase ve bu nedenle doku hiç sinyal arasındaki ışık reaksiyonu olacaktır.
- UV ışınlarına maruz kalan, vibratome steril bir bıçak takın.
3. Prosedür Dilimleme SCN
Aşağıdaki yordam, yetişkin, genellikle 2-4 ay, eski C57/BL6 fareler dilimleme açıklamaktadır. Lütfen kesme işlemi, hem de gece boyunca hayvan ışığa maruz kalma gibi farklı SCN aşamasında sıfırlayabilirsiniz: dikkat. Bunu önlemek için, hiç önemli aşama 12 prosedür nedeniyle meydana gelen kaymalar kesme ve kültür, tercihen ZT 6-12 arasında, ışık saatleri boyunca olmalıdır. SCN karanlıkta numune alınacak varsa, 3.1 ve 3.2 ışık kaynaklı faz değişimleri önlemek için kırmızı ışık veya gece gözlük ile yapılması gereken.
- Fare, tercihen bir gla isofluorane (Baxter) anestezisiss kamara. Hayvan ağrı refleksleri (pençe çivi ile sıkıştırarak kontrol) kaybetti, ancak henüz (oksijen kaynağı mümkün olduğunca uzun süre korumak için) solunum durmuş değil, hızla makas ya da benzeri bir çift ile baş başını kesmek.
Lütfen dikkat: hayvan kaygı teşvik etmek olmasına rağmen, bazı ülkelerde CO 2 pozlama (hiperkapni) hala, anestezi yöntemi olarak izin verilir. Buna ek olarak, servikal dislokasyon dekapitasyon önce gerekli olabilir. Hayvanlar euthanizing yerel mevzuat takip edin. - SCN zarar verebilir optik sinirler, daha fazla gerginlik ve uyarma önlemek için makas ile baş gözleri çıkarın.
- Eğer hala eklenmiş, böylece verme, makas ile son servikal omurgalı kaldırmak için, cilt (Şekil 1a) çıkarın ve ince bir makas (Örneğin iris makası) çifti ile iki keser, kenarları boyunca kafatasının her iki tarafında az bir kesim yapmak çıkarılabilir bir "kapak".
- Kafatası mikro rongeur aracı (ince diseksiyon makas bir fare de kullanılabilir) ile açın ve koku ampuller görülebileceği kadar tüm kemik kaldırmak. İş yukarı, ventral SCN (Şekil 1b) zarar görmesini önlemek amacıyla, aracı ile beynin aşağı doğru bastırarak asla.
- Ince mikro diseksiyon yaylı makas kullanılarak koku soğanları ve hemisferlerin arasındaki optik sinir dikkatlice kesin. SCN ve rüptüre dilim hasara yol açabilir, optik sinir germe beri sinir tamamen kesilmiş olduğundan emin olun.
- Baş baş aşağı çevirin ve bozulmamış beyin ile dolu bir kap içine (örneğin bir cam petri ≈ 10 cm) (hala beyne bağlı, diğer kranial sinirlerin optik sinir kaudal kesilecek gerekebilir) düşmesine izin 50-100 ml soğuk HBSS beynin hızlı soğutma sağlar. İdeal olarak, iki optik sinirlerin bozulmadan kalmalıdır (Şekil 1c). Beyin, beyin soğutmalı olduğundan emin olun HBSS 30-60 saniye tutun.
- Ya da benzer bir kaşık kullanın ve (örneğin bir cam petri kapak başaşağı) steril bir kesim yüzeyi, soğutulmuş beyin, dorsal yüzeye kadar bir yer. Koronal kesim hazırlamak için, böylece beyincik çıkarırken, steril Jilet veya neşter ile hemisferlerin ve beyincik arasında dik bir kesim yapmak.
- Vibroslicer / vibratome ait kuru bir platform üzerinde superglue uygulayın.
- Rostral kısmı keskin, kavisli bir forseps takarak beyin (beyincik olmadan ve koku alma ampuller olmadan serebral hemisferlerin) Pick up ve forseps ile dikkatli bir şekilde hala beyin tutarak, steril bir filtre kağıdı HBSS kuru. (Forseps ekleme yerine, steril filtre kağıdı küçük bir parça beyin eklemek ve aktarmak için kullanılan olabilir).
- Hemisferlerin rostral ucu yukarı ve kesme bıçağı yakın ventral yapıştırılmış bir platform üzerine sabitleyin. Vibratome (örneğin Chipping Instruments, İngiltere) ait sahibinin platform takın ve hemen soğuk HBSS ile doldurmak. Dik kesilmiş düzgün bir şekilde yapılırsa, hemisferlerin böylece ikili SCN içeren koronal kesim yapmak için gerekli olan iyi bir açı kadar düz durmalı.
- Hedef SCN alanına ulaşmak için hemisferlerin kalın bölümler (500-800 mikron), vibratome yüksek ya da maksimum hız keserek başlayın. Bıçak taşıma hipotalamus ulaşmadan başında oldukça hızlı olabilir ama optik kiazma görünür duruma geldiğinde yavaşladı olmalıdır (böylece dilim canlılığı artırarak, yüksek frekanslı titreşimli bıçak ve yavaş hareket yatay dilimleme sırasında hücre hasarı azaltır). Bölümleri 100 mikron optik kiazma büyür (geniş) ve ön komissür küçülür azaltın. Iki SCN çekirdekleri ortaya çıkmaya başlayana kadar bir orta SCN bölümünde elde etmek için, (kaudal yönde) kendinizi "aşağı" çalışmak. Bir büyüteç, çekirdekleri görüntülenmesi için gerekli olabilir. Lütfen dikkat: sıçan beyin ile karşılaştırıldığında fare beyin SCN optik kiazma daha kaudal bulunmaktadır.
- SCN istenilen seviyeye ulaşıldığında (SCN bu noktada, daha tanımlı olarak görünür yuvarlak veya badem şeklindeki yapılar; Şekil 1d; yaklaşık fare 13, bregma SCN merkez bölge için bregma-0.46--0.70 mm - sıçan 14 için 0.92 -1.40 mm), SCN bölümü (Şekil 1e) kesti. Dilim uygun kalınlıkta fare 250 ± 50 mikron, sıçan 350 ± 50 mm.
- Yumuşak bir fırça kullanarak, asansör ve soğuk HBSS ile dolu bir diseksiyon mikroskobu veya Stereoskop altına yerleştirilen bir petri, orta ölçekli bir kapak SCN dilim transferi. Büyütme altında ikili SCN açıkça görünür olup olmadığını kontrol edin. SCN orta bölge (dilimleme prosedürü standartlaştırmak ve farklılıkları azaltmak için en kolay yol olduğunu görüyoruz mutlaka sadece "optimal" bir dilim düzeyde olabilir ama olmayabilir hangi) seçilecek olursa, en azından açıkça görülebilir bir tarafındadilim bölüm. Kesim çok rostral ise, başka bir bölüm ve büyütme altında SCN olup olmadığını kontrol edin.
4. Organotipik SCN Kültürü
- HBSS ile dolu petri kapağı, steril neşter diseksiyon mikroskop altında bir çift ile bir kare doku (~ 1.5 mm her iki tarafta) olarak ikili SCN teşrih. Küçük bir parça optik kiazma eksplant bağlı kalacak, ancak başka hiçbir çekirdekleri dahil edilmelidir. SCN doku çıkarmadan mümkün olduğunca yakın kesin.
- Eğer planlanan deney için uygun, ikili SCN daha sonra iki tek taraflı SCN elde etmek için yarım kesilmiş olabilir. Bir tek taraflı SCN sonra kontrol (Şekil 2a) olarak kullanılabilir.
- 1200 mcL luciferase orta ≈ 35 mm Petri kabı içine doldurun ve sıvı yüzey (2b) üstüne bir kültür membran (Milli-CM 0.4 mikron Millipore, Bedford, MA). Kültür membran şamandıra veya orta 11 kaya, kültür çanak baz güvenli değil oturmak gerektiği gibi kültür orta hacimli, çok önemlidir. Membran altında hiç hava kabarcığı olmadığından emin olun. Luciferase ile çalışırken gereksiz ışık maruz kalmaktan kaçınınız.
- Eksplantlar almak için küçük ve zor. Bu nedenle + ucu içine SCN eksplant emmek ve membran basın ucu 1000 mcL pipet kullanın. Ucu steril bir aracı ile daha geniş bir açılımı oluşturmak için kesilebilir; eksplant 1000 mcL pipet (ve fare ikili SCN örneğin sıçan SCN) kolayca içine sığmayacak kadar büyük. Pipet ile zar aşırı HBSS atın. Lusiferaz kayıt için kayıt tüpler çanak yayılan bütün fotonlar algılar ve farklı dokulardan gelen sinyalleri arasında ayrım yapmıyor, sadece bir SCN / çanak (Şekil 2b) yerleştirin.
- Cam bir kapakla (≈ 40 mm, Menzel-Gläser, Almanya) ve vakum gres (Dow Corning Corp, ABD) 11 ile bulaşık Seal. Mühür (Şekil 2c) sıkı olduğundan emin olun. Aksi takdirde, daha fazla yağ ile mühür.
- 36-37 ° C ışık geçirmez oda bulaşıkları transferi ve PMT-kayıtlar hemen başlayabilirsiniz.
5. Kayıt Biyoparlaklık Lusiferaz Faaliyet ölçümü
Küçük SCN doku Lusiferaz kaynaklı biyoparlaklık sinyalleri tespit ve sıkı bir ışık odasının içine monte photonmultiplier tüp (PMT) detektörü meclisleri ile güçlendirilir. Proje Yönetim Ekipleri, normal kültür yemekleri 8 ~ 1-2 cm yukarıda konumlandırılmış . PMT kayıt kurulumları ısmarlama ya da 11 ticari olarak kullanılabilir.
- PMT (PMT üretilen ısı cam kapak üzerinde yoğunlaşma kaldıracaktır) altında çanak odasına koyun ve kapatın. Odanın (az 20 fotonlar / dak)% 100 olarak ışık geçirmez SCN dokular için kullanılan Proje Yönetim Ekipleri karanlık sayısı çok düşük olduğunu emin olun. Proje Yönetim Ekipleri, zayıf ışık sızıntısını bile algılar.
- Yazılım (Örneğin LumiCycle Actimetrics Inc Wilmette, IL, USA) ile gerçekleştirilen veri toplama, başlayın. Foton sayar gen / protein ekspresyonu yüksek çözünürlük elde etmek için 1-10 dakika aralıklarla üzerinde entegre edilmiştir.
- ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono Till Roenneberg, Münih Üniversitesi, kayıt işlemi tamamlandıktan sonra, elde edilen gen / protein sirkadiyen ifade, uygun bir yazılım (Origin, OriginLab, Northampton, MA, ABD ile analiz edilebilir Münih, Almanya) faz, periyot (bir döngü süresi) ve ritim genlik belirlemek için. Gen veya protein pik ifade çoğunlukla referans noktası olarak kullanılır ve bir döngü sırasında en yüksek foton sayısı olarak tanımlanır. Veri sinyal / gürültü oranı düşük, özellikle de faz, periyot ve genlik analizi önce düzeltilmelidir. Bazal bazen değişiklikler ve analizler önce çıkarılır gerekir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Biz burada salınım PER2 mevcut: LUC ifade kültürlü dokusunun canlılığını ve durum için okumak. Doku PER2, hayatta ise optimal koşullar altında, ve: LUC ifade Şekil 3'te görüldüğü gibi bir sirkadiyen ritim ile dolaşacaktır. SCN PER2 maksimum Zeitgeber Zaman 12-13 (: karanlık döngüsü 12 ZT 12:12 saat ışık ışıklar kapalı temsil eder) etrafında tipik olarak ifade edilir. Boyutu büyük canlı doku, foton sayısı o kadar yüksek olur. Ancak, organotypically kültür dokusunun büyüklüğü ve kalınlığı 500 mikron 7 daha kalın 15 mm 2 11 daha büyük ve tercihen doku canlı tutmak için küçük olmalıdır. SCN doku homozigot PER2 örneklenmiş, burada açıklandığı gibi disseke varsa, genellikle 10.000-40.000/min arasında foton sayısını gösterir: LUC hayvan. Organotipik SCN kültürleri salınım genliği aşağıdaki döngüleri ile karşılaştırıldığında ilk döngüsü sırasında genellikle çok yüksek. Ilk döngüsü çok yüksek amplit neden tamamen açık değildirUde. Olası bir açıklama, doku hücrelerinin önemli bir kısmı, böylece ilk döngüsü sonra luciferase kullanan ilk kesme ve kültür kısa bir süre sonra ölür olabilir. Kesme işlemi de aşırı uyarılma, lusiferaz ilk döngüsü sırasında sinyal yükseltmek neden olabilir.
Şekil 3 SCN dilim lüminesans izlerini gösterir ve başlangıçta sağlıklı bir dilim elde edilen bir iz (kırmızı) içerir. Ölü ya da sağlıksız dokular düşük foton sayısı taban çizgileri var. (Ayrıca, ölü dokular genellikle çanak ilgimiz tek parça membran silinemez.)
Bu raporda açıklanan teknik yararlı farmakolojik deneyler kullanılabilir. Şekil 4 HCN kanal blokeri (ZD7288, 10 mcM) 1 ve 2 arasında tedavi edilen bir kültür bir iz gösterir. Görüldüğü ve daha önce 15 olarak yayınlanacak gibi bloker PER2 sirkadiyen salınım genliği önemli ölçüde azaltılması; Ancak, normal kültür ortamı ile yıkandıktan sonra bloker moleküler saat etkilediğini gösteren salınım, geri geldi ama doku, canlı ve sağlıklı idi.
Şekil 1. Prosedürü Dilimleme
A) Göz ve cilt ile ötenazi dekapite fare başkanı B) kafatası, bir mikro rongeur aracı ile kaldırılır kaldırıldı . Aracını kullanırken, bir yukarı aracı ile çalışmak ve beyin asla bastırın gerekir. C) beynin koku alma ampuller olmadan (ventral yüzü yukarı) baş aşağı gösterilmiştir. Iki sağlam optik sinirler ile beyaz optik kiazma görülebilir. Suprakiazmatik nükleus (SCN sınırları, kırmızı ile işaretlenmiş) yakın optik kiazma yer almaktadır. D) SCN düzeyinde, vibroslicer platforma bağlı bir koronal kesilmiş beyin E) Koronal beyin bölümü (250 mikron kalınlığında) içeren optik kiazma (OC), üçüncü ventrikül (3V) ve ikili suprakiazmatik çekirdek (SCN).
Şekil 2. Organotipik doku kültür.
A) dilim disseke iki tek taraflı SCN çekirdekleri (insert) gösterilir. B) kültür zarı, orta ve eksplant, ancak vakum yağ ve cam kapak olmadan Kültür çanak (35 mm Petri kabında) . Orta (1.2 mL) çanak ve membran arasındaki sıvı olarak görülebilir. Bir tek taraflı SCN çekirdeği kültür zarı üzerine yerleştirilir. Beyaz küçük bir doku parçası, optik kiazma (insert) bir parçasıdır. C), membran ve SCN doku kültürü ile yemek, vakum yağ ve yuvarlak bir cam kapak ile mühürlenir.
Şekil 3. , Sağlıklı ve sağlıklı olmayan SCN doku kültürleri Biyoparlaklık kayıtları .
PERIOD2 biyoparlaklık kayıtları örnekler: Lusiferaz (PER2:: Luc) suprakiazmatik nükleus ifade (SCN) bir 12h tutulan farelerde elde edilen dilimleri: 12h: koyu ışık döngüsü. PER2: LUC protein, protein maksimum ifade Zeitgeber süresi 12-13 oluştuğu bir sirkadiyen varyasyon (~ 24 saat) ile dolaşacaktır. Bu nedenle, gen ritim faz hayvan kurban önce tutuldu ışık karanlık takvime bağlıdır. Tipik olarak, protokol açıklandığı gibi disseke tek taraflı SCN dokulardan biyoparlaklık ~ 10.000-40.000/minute arasında foton sayıları gösterir. Figür, biri sağlıklı (siyah) SCN kültür, sağlıklı olmayan bir SCN kültür (kırmızı) ve (mavi), günde 4 mühürlü kültür çanak açtıktan sonra kurutulan ve düzgün bir çanak yeniden sızdırmazlık SCN kültürünün izleri ( ok ile gösterilen).
Şekil 4. Ilaca maruz kalma sırasında ve sonrasında Biyoparlaklık kaydı.
PER2: LUC ifade öncesinde, sırasında ve bir HCN kanal blokeri (ZD7288, 10 mcM) eylem sonrası bir kültür. Ilk ok bloker eklendi zaman gösterir. Ikinci ok ile yıkanmaya, klimalı ortam ile orta içeren ilaç değiştirerek yapıldı gösterir. Ilaca maruz kalma, günde 4 salınım eksikliği ve yıkanmaya sonra protein ritmi hızlı kurtarma 2 gün sonra azalır genlik Not.
Discussion
Lusiferaz muhabiri teknolojisi ile Avantajlar ve dezavantajlar
Gündüz çalışma için birçok farklı zaman noktalarında (normalde 2-4 saat Örnekleme frekansına bağlı olarak düşük bir zaman çözünürlüğü veren) doku örnekleme gerektiren in situ hibridizasyon ve Western blot, RT-PCR gibi ex vivo yöntemler, aksine gen ve protein ifadelerde değişiklikler lusiferaz muhabiri teknolojisi, yüksek çözünürlük (1-10 dk) aynı hazırlık kaç gün sirkadiyen salınımlar çalışmaları sağlar. Böylece, kullanılan hayvanların sayısı en aza indirgenecektir ve detaylı çalışmalar faz ritim ve dönem üzerindeki etkileri, normalde düşük zaman çözünürlüğü ile geleneksel örnekleme teknikleri kullanarak mümkün değildir, mümkün. Ancak, ritim göreceli genlik ölçümleri mümkün olmasına rağmen, muhabir teknoloji kantitatif değildir ve bu nedenle transkripsiyonu genler veya tercüme proteinlerin miktarlarını ölçmek için kullanılamaz vurguladı olmalıdır.
Doku kayıtlar Organotipik SCN kültürü yetişkin beyin uzun vadeli (hafta) farmakolojik manipülasyon sağlar kültür, doğrudan, in vivo ışık kaynaklı faz vardiya vb, in vivo stres moleküler etkileri eğitim için büyük bir avantaj hemen sonra başlamış ve analiz edilebilir sağlam bir olgun sinaptik ağ ve lusiferaz muhabiri teknolojisi içeren doku, birkaç hafta için kararlı kayıtları sağlar. Böylece, doku yenidoğan veya erken doğum sonrası sağlıklı kültürleri elde etmek için ihtiyaç değildir ve akut dilim kronik farmakolojik tedavilerin aksine yapılabilir. Epigenetik değişikliklerin incelenmesi gereken hücre kültürlerinde DNA genomu içine dahil edilmesi için herhangi bir neden? Plazmid-muhabiri transfections aksine, lusiferaz transgenik hayvan modelleri (yanı sıra Lenti-virüs transfections) tercih edilir. Bu bağlamda da lüminesans görüntüleme kayıtları bile sirkadiyen ritimler okuyan büyük laboratuvarlar tarafından kullanılan tek SCN nöron (~ 6-10 mikron) ve diğer hücre tipleri, izin, günümüzde çok hassas CCD kamera 11 ile mümkün olduğu belirtilmelidir. Son olarak, birkaç sirkadiyen araştırmacılar yaygın saat gen / protein salınımlar 16-19 araştırmak için diğer muhabirler, Yeşil Floresan Protein gibi kullanarak moleküler ifade izleme kullanın.
Kesit kalınlığı Yönleri
Burada önerilen SCN dilim kalınlıkları (200-300 mikron), azalmış ya da istenirse artmış olabilir. Ancak, doku kültüründe bir kaç gün sonra membran üzerinde düzleştirir rağmen, 7 doku canlılığı korumak için başlangıçta kesilmiş dilim 500 mikron kalınlığında aşmak için tavsiye değildir. 100 mikron daha ince bir dilim işlemek için zor bir mekanik ve pratik nedenlerle. SCN (örneğin "kabuk", ve dorsal karşı ventral bölgelerde karşı "çekirdek") içinde farklı bölgelerde farklı aşamalarına salınım SCN dokusu heterojen olduğundan dilim kalınlığı lusiferaz çıkış sinyali faz etkileyebilir, çünkü 20 ve farklı aşamasından sonra yeniden senkronize 21 kaydırır. Daha fazla doku, daha büyük bir sayıda fotonlar yayar beri dilim kalınlığı da foton sayısı temel etkiler. Moleküler salınım genliği eksplant boyutunu bu şekilde dolaylı olarak etkilenebilir. Bu nedenlerden dolayı, kontrol ve tedavi kültürler her zaman aynı boyutta, kalınlık ve SCN aynı bölgede aynı fazda ve aynı genlikli salınım amacıyla içeren olmalıdır. Iki tek taraflı çekirdekleri, diğer taraftan, birbiri ile ve sürece benzer genlikleri faz salınım vibratome kesme açılı (sırayla, beyincik ve iki yarımküresinin arasında kesme ayırma dik olduğunu bağımlı olduğu değil, yatay olarak masa yüzeyi). SCN kültür gerçekleştiren bir araştırmacı SCN kültürlerin birbirleriyle faz salınım olmadığını yaşayabilirsiniz. Dilimleme tekniği Uygulama ve standardizasyon SCN postero-kaudal aynı seviyede, her zaman dilimleri kesilir yani, sonuç artıracak.
Kritik adımlar
- Oksijen kaynağı kritik öneme sahiptir.
Beynin bir çok oksijen 22 gerektirdiğinden, dilimleme işlemi hızlı olması gerekir (3,1-3,10 ne kadar yakınsa o kadar iyi doku sağlıklı tutmak için ~ 5-6 dakika). - SCN sıcaklık değişimleri ve orta döviz duyarlıdır.
SCN ısıya duyarlı ve büyük sıcaklık değişimleri, faz kalp pili kayması ve deneysel eserler 23 neden olabilir . Orta ya da çözümleri örneğin kültür birkaç gün sonra bir ilaç uygulanarak devam eden bir deney, orta ya da eriyik sırasında değiştirilebileceği veya eklenirsen önceden ısıtılmış 36-37 için ° C (odasında aynı sıcaklık) önce eklenmesi gerekir. Orta değişimleri içeren farmakolojik deneyler, her zaman ön şartlı hücre kültür ortamı ile çalışmak önemlidir. Toplama / taze yıkayın, koşulsuz orta potansiyel moleküler SCN ritim 24 gibi diğer hücre tipi kültürleri 25 vardiya faz yapabilirsiniz. - Orta kompozisyon.
Doğru pH ve osmolalitesi doku kültürü önemlidir. Hava-tamponlama orta pH 6,8-8,2 aralığında optimal bir tampon kapasitesine sahip ve aynı zamanda hücre solunumunu bir sonucu olarak ortaya çıkabilir pH değişiklikleri tamponlama için uygun Hepes büyük miktarda içerir. Hepes, diğer taraftan, kültür ortamı az miktarda sodyum bikarbonat ile karşılaştırıldığında gibi sıcaklık değişikliklerine karşı daha duyarlıdır. Sodyum bikarbonat, böylece CO 2 atmosferde uygun düşük pH (5,1-7,1) 26 aralık, daha büyük bir tamponlama kapasitesine sahiptir . Ancak, hava-tamponlama orta (DMEM 2902) sodyum bikarbonat miktarda artış osmolalitesi önemli ölçüde artırır ve aynı zamanda orta, amino asitler, vitaminler ve iyonların yanlış kompozisyon teslim sonuçları. Inceltmeden eklenemez
Ortamın hazırlanması için tavsiyeler:- Orta karıştırma zaman hassas ve dikkatli olun.
- Yalnızca taze ya da taze çözülmüş stok çözümleri kullanın.
- Bir çok yüksek osmolalitesi durumda seyreltilmesi değer değildir. % 5-6 daha seyreltilmiş orta büyük olasılıkla çalışmayacaktır. D-glukoz, çok düşükse osmolalitesi artırmak için kullanın.
- Faz hazırlık süresi nedeniyle vardiya
Dilim hazırlık zamanı kritik önem taşımaktadır. Dilim prosedürü ZT 06-12 Aralık tarihleri arasında yapılan faz sıfır ya da minimal etkisi elde edilir. Tüm dilim diseksiyonları hazırlıkları arasındaki faz değişimi nedeniyle hata en aza indirmek için, gündüz ya da sirkadiyen döngüsünün aynı aşamasında yapılmalıdır.
Olası değişiklikler
- Dilimleme başlamadan önce oksijen (% 95 O 2,% 5 CO 2) ile doymuş tampon, akut SCN elektrofizyoloji, dilimleme Ringer (ACSF Yapay Cerebro Spinal Akışkan) ile yapılacak. Ayrıca, oksijen, elektrik ve sinaptik aktivite 22 oksijen kaynağı doğrudan bağımlı olduğu gibi, tüm dilimleme işlemi sırasında tampon sürekli eklenen olması gerekiyor .
- Yatay ve sagital dilimleri de başarıyla hazırlanmış ve SCN, kültür. Yazarlar koronal kesim ile karşılaştırıldığında bizim deneyimine göre daha düşük genlik ile sirkadiyen salınımlar vermek yatay dilim lusiferaz kayıtları ile deneyime sahip.
- SCN yaklaşık 1 mm uzunluğunda postero-kaudal ve dilimleme tekniği burada açıklanan merkezi bölgede bir SCN bölümünde elde doğru hedeflenmektedir. Ancak, birden fazla SCN bölümünde SCN çekirdeği, daha rostral karşı kaudal seviyelerde sirkadiyen gen / protein ekspresyonu soruşturma izin, fare ve sıçan beyinlerinde elde edilebilir.
- Dilim kültürleri, hatta genç hayvanlar, doğum sonrası yavrular veya embriyolar da hazırlanmış olabilir. Beyin ve kafatası çok genç yavrular çok yumuşak ve duyarlı olduğunu unutmayınız. Buna ek olarak, optik sinir ince ve tam olarak gelişmiş değil. SCN bölge hasarlı olup olmadığını böylece yavruların beyin diseksiyon dikkatli olunuz. Örneğin, onlar çok büyük, çünkü, mikro rongeur araçları fare yavrular kafatası açmak için kullanılır olamaz. Güzel makas genç yavrular yumuşak dokuları kesmek için yeterli.
- Burada açıklanan kapak cam tabanlı bir kültür tekniği, tek SCN nöronlar da, bir CCD / EM-CCD kamera kullanarak görüntü lüminesans için de kullanılabilir.
- PER2 olarak merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde ve transgenik PER2 periferik dokuların: LUC hayvanların kolayca osilasyonları açısından elde kültür ve analiz edilebilir: LUC ifadesi, diğer dokularda bir dizi de kaç gün gidip gelmeye devam ediyor ve hücre tipleri 10. Çoğu bu periferik dokularda, örneğin karaciğer için, hayatta kalmak için bir zar gerektirmez ama yerine doğrudan orta 11 banyolu kültür. Unutmayın, kültür ve orta değişimi nedeniyle kesit değişen bu faz SCN için aynı ilkeleri takip olmayabilir.
Önem
Transgenik fare ve sıçan suşu (: mPER2: LUC mPer1-luc 8, 10, 27) lusiferaz enzim aktivitesi, protein ya da gen ifadesi ritimleri yansıtır ve biyoparlaklık kayıt tespit edilebilir . Lusiferaz oluşturulan biyoparlaklık zayıf bir sinyal verir ama arka plan lüminesans bu yöntemi avantajlı, sıfıra yakın. Ayrıca, lusiferaz molekül dengesiz ve hızlı bir şekilde bozulmuş, çünkü hiçbir Tel varototoksisite, uzun vadeli eksitatör aydınlatma 28 sırasında ortaya çıkabilir. Birlikte ele alındığında, bu özellikleri uzun süren deneyler sirkadiyen araştırma lusiferaz muhabiri teknolojisi oldukça avantajlı hale izin verir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
FONCICYT 000000000091984; Jeansson temellerini Soderstrom Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist ve Sigurd och Elsa Bu çalışma İsveç Tıbbi Araştırma Konseyi (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3) tarafından finanse edildi Goljes Minne ve İsveç Tıp SLS-95151 Derneği. Profesör Gene D. Blok, UCLA, minnetle, el yazması değerli yorumları için kabul edilmektedir. Biz video mikroskobu sağlamak için Dr Michael Andäng ve Dr Helena Johard HCN kanal blokeri için teşekkür eder, ve Prof. Abdel El-Manira.
Etik hususlar:
Karolinska Enstitüsünde ve "Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd" tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak bütün hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Tüm hayvan deneyleri olası stres ya da hayvana rahatsızlık en aza indirmek amacı ile yapılmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Cover glasses | Menzel-Glaser | 40#1 | ≈ 40 mm |
| Culture membranes | EMD Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma-Aldrich | D2902 | Powder for 1L |
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | ≈ 55 mm |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μmPolyethersulfone |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 |
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | 100 ml |
| HBSS 10x | Invitrogen | 14065-049 | 500 ml |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen | 25080-060 | 50 ml |
| Luciferin | Promega Corp. | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | |
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen | 15140-122 | 100 ml |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm |
| PMT | Hamamatsu Corp. | H9319-11MOD | |
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 09-761-5 | |
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | |
| Vibratome | Campden Instruments |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
