准备含有成年小鼠的下丘脑视交叉上核(SCN),和快速的方式来培养器官培养条件的SCN组织切片,程序报告。此外,使用动态的荧光素酶报告技术的振荡时钟基因蛋白表达的测量是描述。
一个中央昼夜时钟(24小时)在生理和行为的协调生活节奏,居住在位于前下丘脑视交叉上核(SCN)的。时钟是由光线通过视网膜和视神经直接同步。昼夜振荡所产生的一些所谓的“时钟基因”,其蛋白产物,包括期间 ( 人事 )基因相互作用的负反馈循环。核心时钟也依赖于细胞膜去极化,钙和1号营地 。的SCN显示在时钟基因的表达,代谢活动和自发的电活动的日常振荡。值得注意的是,这种内源性的循环活动仍然存在的 SCN 2-4成人组织切片。生物钟通过这种方式,可以很容易地在体外进行研究,使心脏起搏器功能的分子,电生理和代谢调查。
SCN是一个小的,定义良好的双边的结构,位于上方的视交叉5。在大鼠,它包含在每个细胞核〜8.000神经元,尺寸约947微米(长度,rostrocaudal轴)x 424微米(宽)x 390微米(高度)6 。剖析是必要的,在特定的大脑可以识别的SCN削减大脑切片的SCN。在这里,我们描述的SCN,这是小鼠和大鼠大脑类似的解剖和切片的过程。此外,我们展示了如何以文化的解剖组织上的膜7,山崎等人开发的一个SCN组织培养技术organotypically 8。最后,我们将演示如何转基因组织,可用于测量生物钟基因/蛋白质使用的动态荧光素酶报告技术,一个原本是用于昼夜测量Geusz等方法 9。的表达。我们这里使用转基因SCN组织敲在PERIOD2:Yoo 等产生的荧光素酶的小鼠 10 。小鼠包含一段时期的融合蛋白(PER),2和萤火虫酶的荧光素酶。 PER2表达PER2当翻译,即荧光素的荧光素酶底物的存在,可以作为生物荧光监测时,荧光素酶催化荧光素的氧化。发射光子的数量,积极相关的生产PER2蛋白质量,生物发光的节奏相匹配PER2蛋白质 在体内10节奏。 PER2表达的周期性变化,在这种方式可以连续监测,实时在许多天。我们组织培养和实时生物发光录音遵循的协议已经彻底山崎和高桥11。
与荧光素酶报告技术的优点和缺点
相比之下体外方法,如RT – PCR技术,原位杂交和免疫印迹,需要在许多不同的时间点(给人一种根据采样频率一般2-4小时的时间分辨率低)的组织取样,以研究昼夜在基因和蛋白表达的变化,荧光素酶报告技术允许在同一准备多天的昼夜振荡的研究高分辨率(1-10分钟)。因此,使用动物的数量最小化,并详细研究的阶段和时期的节奏效果是可行的,通常是不可能使用传统的取样技术的时间分辨率低。然而,虽然节奏相对幅度测量是可能的,但应强调的是,记者的技术是不定量的,因此不能用来衡量翻译转录基因或蛋白质的量。
组织就可以开始录音后立即培养,一个很大的优势,直接研究分子的影响 , 在体内的压力在体内的光致相移等,分析了器官的SCN文化,允许长期(周)成人大脑的药理操纵组织包含一个完整的成熟的突触的网络和荧光素酶报告技术,允许许多个星期的稳定的录音。因此,组织并不需要新生儿或产后早期为了获得健康的文化,并在慢性药物治疗急性切片可以执行。相反的质粒记者转染细胞培养中,那些没有导致基因组DNA纳入,荧光素酶的转基因动物模型(以及lenti病毒转染)是有利的,如果要研究遗传学改变。它应该在这方面还应该提到,发光成像是时下可能与高灵敏度CCD相机11,录音允许单一的SCN神经元(约6-10微米)和其他类型的细胞研究昼夜节律的主要实验室所采用,甚至在。最后,几个昼夜的调查,通常使用使用其他记者,如绿色荧光蛋白,以研究时钟基因/ 蛋白振荡16-19分子表达的监测。
层厚的方面
这里推荐的SCN片(200-300微米)的厚度,可以减少或增加,如果需要的话。不过,虽然组织文化几天后合并膜,它是不建议超过500微米厚度的初步切割片,以维护该组织7可行性。切片厚度超过100微米是难以处理的机械和现实的原因。由于SCN组织是异质的切片厚度可能会影响荧光素酶的输出信号的相位,因为SCN(例如“核心”与“空壳”,背侧与腹侧地区)内不同地区的不同阶段的振荡20和不同的阶段后,重新同步转移21。切片的厚度也影响光子计数的基线,因为更多的组织发出的光子数量较多。分子振荡的幅度可能在这样间接受到影响外植体的大小。基于这些原因,控制和治疗的文化应始终是相同的尺寸,厚度和包含的SCN同一地区以振荡在相同的相位和幅度相同。两个单方面核,另一方面,振荡阶段,彼此只要类似的振幅vibratome削减水平和角度(这又是依赖于切小脑和两个半球之间的分离是垂直台面)。执行的SCN培养的调查可能会遇到的SCN文化不相相互振荡。实践和切片技术的标准化,即片总是削减rostro,尾鳍的SCN在同一水平,提高疗效。
关键步骤
可能的修改
意义
在转基因小鼠和大鼠株(mPER2::LUC的; mPer1 – LUC 8,10,27)荧光素酶的活性反映蛋白质或基因表达节律,可以通过评估生物发光录音。荧光素酶生成的生物发光,给人一种弱信号,但背景发光接近于零,使得这种方法的优势。此外,由于荧光素酶的分子是不稳定的,并迅速退化,有没有pH值耳毒性,它可以出现在长期的兴奋照明 28 。两者合计,这些属性允许长期实验的荧光素酶报告技术的高度优势,在昼夜研究。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由瑞典医学研究理事会(K2009 – 75SX – 21028 – 01 – 3,K2008 – 61X – 20700 – 01 – 3); FONCICYT 000000000091984; Jeansson的基础,Söderström Königska sjukhemmet,玛莎Lundqvist和Sigurd OCH艾尔莎Goljes Minne;和瑞典社会医学SLS – 95151。基因D.座教授,加州大学洛杉矶分校,感谢对稿件的宝贵意见。我们感谢为HCN通道阻滞剂博士迈克尔Andäng和海伦娜Johard博士,教授阿卜杜勒EL – Manira提供视频显微镜。
道德因素:
对所有实验动物是由瑞典卡罗林斯卡医学院和斯德哥尔摩的Norra Djurförsöksetiska Nämnd“所规定的准则和法规的规定执行。所有的动物实验的意图,以尽量减少任何可能的压力或不适的动物。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
Vibratome | Campden Instruments |