Summary
הליך של הכנת פרוסות המכיל את עכבר מבוגר ההיפותלמוס גרעין suprachiasmatic (SCN), ודרך מהירה לתרבות רקמת SCN במצב תרבות organotypic, הם דיווחו. יתר על כן, במדידה של הגן oscillatory ביטוי חלבון שעון דינאמי באמצעות כתב הטכנולוגיה בלוציפראז מתואר.
Abstract
השעון הביולוגי המרכזי (~ 24 שעות) תיאום מקצבים יומיים פיסיולוגיה והתנהגות מתגורר גרעין suprachiasmatic (SCN) הממוקם בהיפותלמוס הקדמי. השעון מסונכרן ישירות על ידי אור דרך הרשתית ועצב הראייה. תנודות היממה מופקים על ידי אינטראקציה לולאות משוב שלילי של מספר "גנים של השעון" מה שנקרא מוצרי החלבון שלהם, כולל התקופה (פר) גנים. השעון הליבה תלוי גם שלילת קוטביות הממברנה, סידן cAMP 1. SCN מראה תנודות יומי בביטוי שעון הגן, פעילות מטבולית לבין פעילות חשמלית ספונטנית. למרבה הפלא, זו פעילות מחזורית אנדוגני נמשכת פרוסות הרקמה הבוגרת SCN 2-4. בדרך זו, השעון הביולוגי יכול בקלות להיות למד במבחנה, המאפשר חקירות מולקולרית, אלקטרו ומטבוליים של פונקציית קוצב לב.
SCN הוא קטן, מוגדר היטב מבנה דו ממוקם ממש מעל התצלובת האופטית 5. בשנת החולדה היא מכילה ~ 8.000 נוירונים בגרעין כל יש ממדים של כ 947 מיקרומטר (אורך ציר rostrocaudal) x 424 מיקרומטר (רוחב) x 390 מיקרומטר (גובה) 6. כדי לנתח את SCN יש צורך לחתוך פרוסת המוח ברמה מסוימת של המוח שבו ניתן לזהות SCN. כאן, אנו מתארים את הליך הניתוח, חיתוך של SCN, אשר דומה העכבר מוחות העכברים. יתר על כן, אנו מראים כיצד תרבות רקמות גזור organotypically על קרום 7, טכניקה שפותחה על ידי התרבות רקמת SCN ימזאקי et al. 8. לבסוף, אנו מדגימים כיצד רקמה מהונדס יכול לשמש למדידת ביטוי של גנים של השעון / חלבונים באמצעות כתב דינמי טכנולוגיה בלוציפראז, שיטה במקור שימש למדידות היממה על ידי Geusz et al. 9. אנחנו כאן להשתמש ברקמות SCN מן מהונדס עקום ב PERIOD2: עכברים בלוציפראז המיוצר על ידי יו ואח' 10.. העכברים מכילים חלבון היתוך תקופה (PER) 2 ו בלוציפראז אנזים הגחלילית. כאשר PER2 מתורגם בנוכחות המצע עבור בלוציפראז, כלומר luciferin, הביטוי PER2 ניתן לנטר כמו פליטת אור כאשר בלוציפראז מזרז חמצון של luciferin. מספר הפוטונים הנפלטים חיובי בקורלציה לכמות חלבון המיוצר PER2, לבין מקצבים פליטת אור להתאים את קצב חלבון PER2 in vivo 10. בדרך זו וריאציה מחזורית בביטוי PER2 ניתן לפקח באופן רציף בזמן אמת במהלך ימים רבים. הפרוטוקול אנו עוקבים עבור culturing רקמות בזמן אמת, הקלטה פליטת אור תוארה באופן יסודי על ידי ימזאקי ו טקהאשי 11.
Protocol
1. הפתרון הכנה
- תרבות בינוני עם קיבולת אוויר חציצה
- מלאו בקבוק 1 ליטר עם כ 800 מ"ל סטרילי H 2 O (autoclaved milliQ H 2 O).
- תוך ערבוב, מוסיפים ומערבבים חומרים הבאים: 1 מיכל הגלוקוז נמוכה, סרום ללא אבקת 2902 DMEM ללא סודיום ביקרבונט ו פנול אדום (אדום פנול מפריע האות פליטת אור), 20 מ"ל תוסף B27 50x, 4.7 מ"ל של 7.5% NaHCO 3 פתרון (או 0.35 גרם NaHCO 3), 10 HEPES מ"ל 1M, 2.5 מ"ל PenStrep 10,000 יח' / מ"ל ו 3.5 גרם D-גלוקוז. בואו בינוני ומערבבים עד המרכיבים מתמוססים לגמרי.
המדיום האחרון (1 ליטר) יכלול:
1x DMEM, 1x תוסף B27, 4.2 mM NaHCO 3, HEPES 10 מ"מ, 25 U / mL פניצילין, 25 U / mL סטרפטומיצין ו 19 מ"מ D-גלוקוז. - התאם ל-pH 7.2, באמצעות NaOH כדי להקטין או להגדיל את HCl pH, ולהביא נפח עד 1 ליטר עם סטרילי H 2 O.
- התאם osmolality עם H 2 O (osmolality ירידה) או D-גלוקוז (osmolality להגדיל). Osmolality חייב להיות בין 285-315 mOsm / ק"ג, אך בטווח האופטימלי הוא 300-310 mOsm / ק"ג. אין לדלל את המדיום יותר מ 5%.
- סינון בינוני תרבות באמצעות קורנינג סינון סטרילי ריק קובע (למשל 2 x 500 מ"ל עם גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר) במנדף סטרילית. שמור את בינוני 4 ° C ולהגן עליו מפני האור באמצעות רדיד אלומיניום. אנו ממליצים כי המדיום משמש תוך 3 חודשים.
- האנק של מלח פתרון מאוזן (HBSS) חיץ עם תוספות (עבור פרוסות חיתוך)
- מלאו בקבוק זכוכית 1 ליטר עם ~ 600 מ"ל סטרילי (autoclaved milliQ) H 2 O ומוסיפים את החומרים הבאים: 100 מ"ל HBSS מניות 10x, 10 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 10,000 יח' / מ"ל, 5 מ"ל של פתרון 7.5% NaHCO 3 ו 10 מ"ל HEPES 1M.
הפתרון הסופי יכיל גזירה:
HBSS 1x, 10 HEPES מ"מ, 4.5 mM NaHCO 3, 100 U / mL פניצילין 100 U / mL סטרפטומיצין. - בדוק pH, ואם יש צורך, כדי להתאים את pH 7.2 ולהביא את נפח עד 1 ליטר עם סטרילי H 2 O.
- בדוק osmolality, אשר חייב להיות בין 285-315 mOsm / ק"ג.
- מצננים את HBSS עד 4 ° C. חיץ HBSS צריך להיות קר מאוד (4 מעלות צלזיוס) במהלך חיתוך / קיצוץ ההליך על מנת להפיל את חילוף החומרים ולשמור על הכדאיות רקמות.
- מלאו בקבוק זכוכית 1 ליטר עם ~ 600 מ"ל סטרילי (autoclaved milliQ) H 2 O ומוסיפים את החומרים הבאים: 100 מ"ל HBSS מניות 10x, 10 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 10,000 יח' / מ"ל, 5 מ"ל של פתרון 7.5% NaHCO 3 ו 10 מ"ל HEPES 1M.
2. הכנות לפני Slices חיתוך culturing
- רקמות הם מתורבתים בתא יבש חם ללא CO 2. כדי למנוע התייבשות התרבויות צריך להיות אטום עם המשקפיים לכסות המצורפת את הכלים על ידי שומן. לענין זה, למלא 5 מ"ל מזרקים עם גריז סיליקון מבוססי ואקום. מכסים את טיפים מזרק עם חתיכות קטנות של נייר אלומיניום ו החיטוי אותם. כמו כן, החיטוי לסנן ניירות (המשמש במהלך חיתוך ההליך).
- ממש לפני חיתוך ההליך, למרוח משחה ואקום autoclaved על פני השטח את הטבעת העליונה של 35 מ"מ צלחות פטרי. הכינו צלחת פטרי נפרד לתרבות כל פרוסה.
- לפני שמתחילים לחתוך כל הליך שאינו סטרילי מכשירים, סכיני גילוח, סכיני vibratome, כוסות מכסים חומר אחר המשמש הליך פרוסה והתרבות צריכים להיות מעוקרים. ריסוס כל ציוד שאינו סטרילי עם אתנול 70%. לחשוף את המכשירים ואת בצלחות פטרי משומנת עם UV במנדף סטרילי לחשיפה דקות לפחות 30 UV לפני culturing.
- באותו זמן, למלא צינור פלקון עם המדיום אוויר חציצה תרבות (לספור 1.2 מ"ל של כל תרבות, של 8 תרבויות להתכונן בינוני למשל 10 מ"ל) ולהוסיף luciferin מופשר טרי (0.1 פתרון M המניות; Promega, במדיסון, וויסקונסין) (10 luciferin μL עד בינוני 10 מ"ל; הריכוז הסופי 0.1 מ"מ).
- Luciferin הוא אור רגיש הן פתרונות מניות המדיום luciferin המכילים צריך להיות מוגן מפני אור. מניחים את הצינור פלקון עם בינוני luciferin ב תא כהה 36-37 מעלות צלזיוס החימום. במידת הצורך, luciferin ניתן גם להוסיף ישירות את הכלים תרבות בעת חיתוך. אם luciferin לא הוסיף, לא תהיה תגובה בין אור בלוציפראז ו luciferin ולכן אין אות מן הרקמה.
- לאחר החשיפה UV, לצרף להב סטרילי כדי vibratome.
3. SCN בחותכו נוהל
ההליך הבא מתאר חיתוך של מבוגר, בדרך כלל 2-4 חודשים, C57/BL6 עכברים. שימו לב: את ההליך חיתוך, כמו גם חשיפה לאור של החיה במהלך הלילה, יכול דיפרנציאלי לאפס את השלב של SCN. כדי להימנע מכך, חיתוך ו culturing צריכה להתבצע בשעות האור, עדיף ZT בין 6-12, כאשר אין שלב משמעותי משמרות בשל ההליך להתרחש 12. אם SCN יש שנדגמו בחושך, 3.1 ו -3.2 צריך להתבצע באור אדום או עם משקפי לילה, כדי למנוע אור-Induced משמרות שלב.
- רצוי להרדים את העכבר על ידי isofluorane (Baxter) ב GLAss קאמרית. כאשר החיה איבד רפלקסים הכאב שלה (לבדוק על ידי צובט עם הציפורניים בכף), אבל לא הפסיק עדיין נושם (כדי לשמור על אספקת חמצן זמן רב ככל האפשר), במהירות לערוף את הראש עם זוג מספריים או דומה.
שים לב: במדינות מסוימות CO 2 חשיפה (hypercapnia) מותר עדיין כשיטת הרדמה, אם כי דווחה על מנת לקדם חרדה בבעלי חיים. בנוסף, נקע בצוואר הרחם עשוי להידרש לפני עריפת ראש. אנא עקוב החקיקה המקומית כאשר והרדמת חסד בבעלי חיים. - הסר את העיניים מהראש במספריים כדי למנוע מתח עירור נוסף של עצבי הראייה, אשר עלולה לגרום נזק SCN.
- אם עדיין מחוברת, להסיר את חוליות צוואר הרחם האחרון במספריים, להסיר את העור (איור 1 א) ולעשות שני חתכים עם זוג מספריים קנס (למשל עבור מספריים קשתית), חתך אחד בכל צד של הגולגולת לאורך הצדדים, ובכך "מכסה" נשלף.
- פתח את הגולגולת עם כלי rongeur מיקרו (מספריים לנתח קנס יכול לשמש גם על עכבר) ולהסיר את כל עצם עד נורות הריח ניתן לראות. מעלה עבודה, לא לוחצת את המוח עם הכלי, על מנת למנוע נזק של SCN הגחון (איור 1b).
- בזהירות לחתוך את עצב הראייה בין נורות הריח ואת חצאי באמצעות מיקרו בסדר לנתח מספריים האביב. ודא כי עצב הוא לחתוך לחלוטין מאז מתיחה של עצב הראייה יכולה לגרום לנזק ב SCN ואת פרוסות מקרע.
- סובבו את הראש כלפי מטה ולתת למוח שלם לנשור (אם עדיין מחוברים אל המוח, עצבי הגולגולת אחרים ייתכן שיהיה צורך לחתוך הזנב לעצב הראייה) לתוך מיכל (למשל צלוחית זכוכית שהיתה ≈ 10 ס"מ) מלא 50-100 מ"ל HBSS קר המאפשר קירור מהיר של המוח. באופן אידיאלי, שני עצבי הראייה צריכה להישאר ללא פגע (איור 1 ג'). שמור את המוח של 30-60 שניות HBSS כדי לוודא את המוח הוא מקורר.
- בעזרת כף או דומה ומקום המוח צונן, משטח הגב למעלה, על משטח חיתוך סטרילי (למשל מכסה זכוכית צלחת פטרי הפוכה). על מנת להכין לחתוך העטרה, להפוך את לחתוך בניצב עם סכיני גילוח או אזמלים סטרילי בין אונות המוח ובין המוח הקטן, ובכך להסיר את המוח הקטן.
- החל דבק מגע על פלטפורמה יבשה השייכים vibroslicer / vibratome.
- תרימי את המוח (אונות המוח מבלי המוח הקטן וללא נורות חוש הריח) על ידי החדרת חדה, מלקחיים מעוקל בחלק מקורי בזהירות את HBSS יבש על נייר סינון סטרילי, עדיין מחזיק את המוח עם מלקחיים. (במקום החדרת מלקחיים, פיסה קטנה של נייר סינון סטרילי ניתן לצרף ולהעביר את המוח).
- תקן את ההמיספרות על גבי פלטפורמת מודבק עם למעלה טיפ מקורי משטח הגחון הקרובים להב החיתוך. צרף את פלטפורמת בעל השייכים vibratome (למשל מ Campden מכשירים, בריטניה) ומיד למלא אותו עם HBSS קר. אם לחתוך בניצב נעשית כראוי, ההמיספרות צריך לעמוד זקוף ובכך לספק זווית טובה הדרושים לביצוע חתך העטרה המכיל את SCN בין שתי המדינות.
- כדי להגיע לאזור SCN היעד, להתחיל לחתוך חלקים עבים (500-800 מיקרומטר) של ההמיספרות במהירות גבוהה, או לכל היותר vibratome. העברת להב יכול להיות מהיר למדי בהתחלה לפני שהגיע ההיפותלמוס אבל צריך להאט כאשר התצלובת האופטית הופך לגלוי (תדירות גבוהה של הלהב רטט ותנועה אופקית איטית מקטין נזק לתאים במהלך חיתוך, ובכך להגדיל הכדאיות פרוסה). מנמיכים את הסעיפים עד 100 מיקרומטר כאשר התצלובת האופטית הופך גדול יותר (רחב) ו השליכה הקדמי הופך להיות קטן יותר. על מנת לרכוש קטע אמצע SCN, העבודה בעצמך "למטה" (כיוון הזנב) עד שני גרעינים SCN מתחילים להופיע. זכוכית מגדלת עשוי להיות נחוץ עבור לדמיין את הגרעינים. שימו לב: SCN במוח העכבר ממוקם הזנב יותר התצלובת הראייה לעומת במוח חולדה.
- כאשר הרמה הרצויה של SCN הושג (SCN יהיה בשלב זה מופיעים כהגדרתו יותר, מבנים עגולים בצורת או שקדים; איור 1d, כ גבחת-0.46--0.70 מ"מ באזור מרכז SCN ב 13 העכבר, גבחת - 0.92-ל -1.40 מ"מ חולדה 14), לחתוך את החלק SCN (איור 1e). עובי מתאים של הפרוסה היא העכבר 250 ± 50 מיקרומטר; עבור עכברוש 350 ± 50 מיקרומטר.
- בעזרת מברשת רכה, להרים ולהעביר את הפרוסה SCN אל מכסה של צלחת פטרי בגודל בינוני מלא HBSS קר, תחת מיקרוסקופ לנתיחה או stereoscope. בדוק בהגדלה אם SCN הבילטרליים נראה בבירור. אם באמצע אזור של SCN ייבחר (מה שלא בהכרח רק לרמת "אופטימלי" פרוסה אך אנו רואים היא הדרך הקלה ביותר כדי לתקנן את ההליך לחתוך ולהקטין וריאציה), יש לראות בבירור לפחות צד אחד שלפרוסה סעיף. אם החתך היה מקורי מדי, לעשות עוד סעיף ולבדוק SCN תחת הגדלה.
4. SCN Organotypic תרבות
- במכסה צלחת פטרי מלאות HBSS, לנתח את SCN דו צדדי כמו רקמה ריבוע (~ 1.5 מ"מ לכל צד) עם זוג אזמלים סטריליים תחת מיקרוסקופ לנתח. פיסה קטנה של התצלובת הראייה תישאר מחוברת explant, אך לא גרעינים אחרים צריך להיות כלול. גזור קרוב ככל האפשר מבלי להסיר רקמת SCN.
- אם מתאים הניסוי המתוכנן, SCN בין שתי המדינות לאחר מכן ניתן לחתוך לחצי לקבלת שתי SCN חד צדדית. אחת SCN חד צדדי לאחר מכן ניתן להשתמש כמו הביקורת (איור 2 א).
- מילוי 1200 μL של בינוני luciferin לתוך צלחת פטרי ≈ 35 מ"מ במקום קרום תרבות (מילי-CM 0.4 מיקרומטר, Millipore, בדפורד, מסצ'וסטס) על גבי משטח הנוזל (2b). נפח בינוני תרבות הוא חיוני, כמו קרום תרבות צריכה לשבת בבטחה על בסיס צלחת את התרבות, לא לצוף או רוק ב 11 בינוני. ודא שאין בועות אוויר תחת הממברנה. המנעו מחשיפה לאור מיותר כאשר עובדים עם luciferin.
- Explants קטנים קשה להרים. לכן להשתמש פיפטה 1000 μL + טיפ למצוץ את explant SCN אל קצה ולחץ אותו על הממברנה. במקרה explant הוא גדול מדי בקלות להשתלב טיפ 1000 פיפטה μL (למשל SCN חולדה; ו SCN עכבר דו צדדי) את קצה ניתן לחתוך עם כלי סטרילי כדי ליצור פתח רחב יותר. בטל HBSS מופרז על הממברנה עם פיפטה. להקלטת בלוציפראז, במקום אחד בלבד SCN / צלחת (איור 2b) כמו צינורות הקלטה לזהות את כל הפוטונים הנפלטים מן התבשיל ואין להבחין בין אותות רקמות שונות.
- חותם את המנה עם כוס לכסות (≈ 40 מ"מ, Menzel-גלזר, גרמניה) גריז ואקום (Dow Corning Corp, ארה"ב) 11. ודא החותם הוא הדוק (איור 2 ג). אם לא, חותם עם גריז יותר.
- העברת את הכלים כדי קאמרית 36-37 ° C אור חזק ולהתחיל PMT-הקלטות מיד.
5. מדידה של פעילות בלוציפראז על ידי פליטת אור הקלטה
בלוציפראז-Induced אותות פליטת אור מרקמת SCN קטנים לאתר מוגבר עם photonmultiplier שפופרת (PMT) מכלולים גלאי מותקן בתוך חדר אור חזק. PMTs ממוקמים בדרך כלל ~ 1-2 ס"מ מעל את הכלים תרבות 8. Setups PMT ההקלטה יכולה להתבצע אישית או זמינים מסחרית 11.
- מניחים את צלחת תחת PMT (החום המופק PMT יסיר התעבות על זכוכית לכסות) ולסגור את החדר. ודא החדר הוא 100% אור חזק כמו לספור האפל של PMTs המשמש רקמות SCN הוא נמוך מאוד (פחות מ 20 פוטונים / min). PMTs לזהות אפילו את זליגת האור החלש ביותר.
- הפעל את רכישת נתונים, אשר מתבצעת עם תוכנה (למשל עבור LumiCycle; Actimetrics Inc, Wilmette, אילינוי, ארה"ב). ספירת פוטון משולבים על מרווחי 1-10 דקות כדי לקבל רזולוציה גבוהה של ביטוי גנים / חלבון.
- לאחר סיום ההקלטה, הביטוי היממה שהושגו של הגן / חלבון ניתן לנתח עם התוכנה המתאים (מקור, OriginLab, Northampton, מסצ'וסטס, ארה"ב; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; כרונו, עד Roenneberg, אוניברסיטת מינכן, מינכן, גרמניה) כדי לקבוע שלב, תקופה (זמן מחזור אחד) ואת המשרעת של קצב. שיא הביטוי של גן או חלבון משמש בעיקר כנקודת התייחסות מוגדרת לספור את פוטון הגבוהה ביותר במהלך מחזור אחד. הנתונים יכולים להיות מוחלק לפני ניתוח של התקופה שלב, ואת משרעת, במיוחד אם יחס אות / רעש נמוכה. הבסיס לפעמים שינויים צריכים להיות מופחתים לפני הניתוחים מבוצעים.
6. נציג תוצאות:
כאן אנו מציגים את PER2 oscillatory: הביטוי לוק כמו לקרוא על הכדאיות ומצבו של הרקמה תרבותי. בתנאים אופטימליים, ואם ברקמה חיה, PER2: הביטוי לוק נעה בקצב היממה כפי שמוצג באיור 3. PER2 ב SCN מתבטא מקסימאלי בדרך כלל סביב השעה Zeitgeber 12-13 (שם ZT 12 מייצג את האורות בבית לשעה 12:12 אור: מחזור כהה). גדול בגודל רקמת חיים הוא, גבוה יותר לספור פוטון הופכת. עם זאת, גודל ועובי רקמות בתרבית organotypically צריך להישמר קטן כדי לשמור על הרקמה קיימא, רצוי לא גדול מ 15 מ"מ 2 11 ולא עבה יותר מ -500 מיקרומטר 7. SCN, אם גזור כפי שתואר כאן, בדרך כלל מראה ספירת פוטון בין 10.000-40.000/min אם רקמה היא שנדגמו PER2 הומוזיגוטים: חיים לוק. משרעת של תנודה בתרבויות SCN organotypic הוא בדרך כלל גבוה מאוד במהלך המחזור הראשון לעומת המחזורים הבאים. זה לא לגמרי ברור מדוע המחזור הראשון יש amplit גבוהה מאודאודה. הסבר אפשרי אחד הוא כי חלק ניכר של תאים ברקמת עלולים למות זמן קצר לאחר חיתוך culturing הראשוני, ולכן לא ניצול luciferin אחרי המחזור הראשון. ההליך חיתוך עלולים גם הם לגרום עירור יתר, אשר יכול להגביר את האות בלוציפראז במהלך המחזור הראשון.
איור 3 מראה עקבות הארה מן פרוסות SCN ומכיל שריד אחד (אדום) המתקבל פרוסת זה לא היה בריא מלכתחילה. רקמות המלח או בריא צריך ערכי הבסיס נמוך לספור פוטון. (בנוסף, לעתים קרובות לנתק רקמות מתות בצלחת ולא ניתן להסיר את הקרום בחתיכה אחת.)
הטכניקה שתוארו בדו"ח זה יכול לשמש לטובה בניסויים פרמקולוגיים. איור 4 מראה שמץ מתרבות כי התייחסנו בין יום 1 ו -2 עם חוסם ערוץ HCN (ZD7288, 10 מיקרומטר). כפי שניתן לראות בתרשים ו כפי שפורסם בעבר 15, חוסם משמעותית את המשרעת של תנודה של היממה PER2, עם זאת, לאחר שטיפה עם המדיום תרבות נורמליים תנודה חזר, הוכחת כי חוסם השפיע על השעון המולקולרי אבל הרקמה היתה קיימא ובריא.
באיור 1. חיתוך נוהל
א) ראש של עכבר ערופה מורדמים בעיניים ובעור הוסרו. B) הגולגולת מוסרת עם כלי rongeur מיקרו. כאשר השימוש בכלי, יש לעבוד כלפי מעלה ולא לחץ כלפי מטה את המוח עם הכלי. C) המוח הראו במהופך (עד הצד הגחוני) ללא נורות חוש הריח. התצלובת אופטי לבן עם שני עצבי הראייה שלם ניתן לראות. גרעין suprachiasmatic (SCN, הגבולות המסומנים באדום) ממוקם קרוב התצלובת הראייה. D) מוח לחתוך coronally המצורפת הרציף vibroslicer, ברמה של SCN. E) במוח סעיף העטרה (250 מיקרומטר עבה) המכיל את התצלובת האופטית (OC), השלישי החדר (3V) ואת הגרעינים suprachiasmatic הבילטרליים (SCN).
איור 2. רקמה Organotypic culturing.
א) שני גרעינים SCN חד צדדית (להוסיף) גזור מן פרוסה המוצג. B) המנה תרבות (35 מ"מ צלחת פטרי) עם קרום תרבות, בינוני explant, אבל בלי שומן ואקום זכוכית המכסה. בינוני (1.2 מ"ל) ניתן לראות נוזל בין המנה לבין הממברנה. אחת הגרעין SCN חד צדדית מושם על הממברנה תרבות. החלק הלבן של הרקמה קטן הוא פיסת התצלובת הראייה (להוסיף). ג) צלחת תרבות עם קרום שלה רקמת SCN שלו, אטום עם גריז ואקום זכוכית לכסות עגול.
איור 3. פליטת אור הקלטות מתרבויות רקמה בריאה ולא בריא SCN.
דוגמאות והקלטות של פליטת אור PERIOD2: ביטוי גרעין suprachiasmatic (SCN) פרוסות שהתקבלו בעכברים שנערך 12 שעות: בלוציפראז (לוק PER2:): מחזור כהה: 12 שעות אור. PER2: חלבון לוק נעה עם וריאציה (~ 24 שעות) היממה שבה ביטוי מרבי של החלבון מתרחשת בזמן Zeitgeber 12-13. לכן, השלב של קצב את הגן תלויה בלוח הזמנים בחושך אור שבו חיה הוחזק לפני הקריב. בדרך כלל, פליטת אור מרקמות SCN חד צדדית גזור כמתואר בפרוטוקול מראה ספירת פוטון בין ~ 10.000-40.000/minute. האיור מציג עקבות מתרבות אחת (שחור) בריא SCN, אחד הלא בריאים תרבות SCN (אדום) ואחד תרבות SCN כי התייבש (כחול) לאחר פתיחת צלחת תרבות חתום ביום 4 ולא איטום מחדש את המנה כראוי ( מסומנים בחץ).
איור 4. פליטת אור הקלטה בזמן ואחרי החשיפה לסמים.
PER2: לוק ביטוי בתרבות לפני, במהלך ואחרי הפעולה של חוסם HCN ערוץ (ZD7288, 10 מיקרומטר). החץ הראשון מציין את הזמן שבו היה חוסם הוסיף. החץ השני מצביע על כשלון, אשר נעשתה על ידי החלפת תרופה המכילה בינוני עם בינוני בקרה ממוזג. שים לב משרעת מופחתת אחרי 2 ימים של חשיפה לסמים, חוסר תנודה ביום 4 ואת התאוששות מהירה של קצב את החלבון לאחר כשלון.
Discussion
יתרונות וחסרונות עם טכנולוגיית הכתב בלוציפראז
בניגוד לשיטות לשעבר vivo, כגון RT-PCR, ב הכלאה באתרו כתם המערב שדורשים דגימה רקמה על רבים בנקודות זמן שונות (מתן החלטה זמן נמוכה בדרך כלל 2-4 שעות, תלוי תדר הדגימה) כדי ללמוד יומי וריאציות ביטויי גנים וחלבונים, הטכנולוגיה מאפשרת כתב בלוציפראז ברזולוציה גבוהה (10-10 דקות) מחקרים של תנודות היממה במשך ימים רבים בהכנת אותו. מחקרים לכן, את מספר בעלי החיים המשמשים ממוזער ומפורט של השפעות על שלב ותקופת קצב הם ריאלי, אשר בדרך כלל אינו אפשרי תוך שימוש בטכניקות דגימה קונבנציונלי עם רזולוציה נמוכה זמן. עם זאת, אף על פי מדידות האמפליטודה היחסית של קצב אפשריים, יש להדגיש כי הטכנולוגיה הכתב אינו כמותי ולכן יכול לא להשתמש כדי למדוד כמויות של גנים או חלבונים עיבד המתורגם.
ההקלטות רקמה ניתן להתחיל לנתח מיד לאחר culturing, יתרון גדול עבור ישירות לומד המולקולרי של תופעות של מתח vivo, in vivo אור-Induced משמרות שלב וכו 'תרבות SCN organotypic מאפשר לטווח ארוך (שבועות) מניפולציה תרופתי של המוח המבוגר רקמה המכילה מערך שלם הסינפטי בוגרת הטכנולוגיה כתב בלוציפראז מאפשר הקלטות יציבה במשך שבועות רבים. לפיכך, הרקמה לא צריך להיות לאחר הלידה בילוד או מוקדם כדי להשיג תרבויות בריא, בניגוד לטיפולים תרופתיים כרונית חריפה פרוסה יכול להתבצע. בניגוד לכתב פלסמיד-transfections בתרביות תאים, אשר אין לעשות להוביל שילוב של ה-DNA לתוך הגנום, מהונדס בלוציפראז דגמים בעלי חיים (כמו גם lenti וירוס transfections) הם נוחים אם שינויים epigenetic הם להיחקר. ראוי בהקשר זה גם לציין כי הדמיה הארה היא כיום אפשרי עם רגישות גבוהה מצלמות CCD 11, המאפשר הקלטות גם נוירונים SCN יחיד (~ 60-10 מיקרומטר) ואת סוגי תאים אחרים, מנוצל על ידי מעבדות מרכזי לימוד מקצבים היממה. לבסוף, החוקרים היממה כמה נפוץ השימוש ניטור הביטוי מולקולריים באמצעות כתבים אחרים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, כדי ללמוד בגן השעון / תנודות חלבון 16-19.
היבטים של עובי פרוסת
עוביים המליצה פה של הפרוסה SCN (200-300 מיקרומטר) יכול להיות מופחת או מוגבר אם תרצה בכך. עם זאת, למרות רקמת משתטחת על קרום אחרי כמה ימים בתרבות, לא מומלץ לעלות על 500 מיקרומטר עובי של הפרוסה לחתוך תחילה כדי לשמר יכולת הקיום של הרקמה 7. פרוסה דק יותר הוא 100 מיקרומטר סיבות מכניות ומעשי קשה להתמודד. מכיוון רקמת SCN הטרוגנית עובי של הפרוסה עשויים להשפיע על השלב של אות פלט בלוציפראז, שכן אזורים שונים בתוך SCN (למשל את "הליבה" מול "קליפה", ואזורים הגב לעומת הגחון) להתנדנד עם שלבים שונים 20 ו דיפרנציאלי מחדש לסנכרן לאחר שלב משמרות 21. עובי של הפרוסה משפיע גם על בסיס של פוטון לספור מאז רקמות פולט יותר מספר גדול יותר של פוטונים. המשרעת של תנודות מולקולריות יכול בדרך זו בעקיפין להיות מושפע גודל explant. מסיבות אלה, מלאה תרבויות התייחסו תמיד צריך להיות באותו עובי של גודל, המכילים את אותו אזור של SCN מנת להתנדנד בשלב אותו עם אמפליטודה זהה. שני גרעינים חד צדדית, מצד שני, להתנדנד בשלב אחד עם השני ועם אמפליטודות דומה עוד לחתוך vibratome הוא אופקי ולא זוויתי (אשר בתורו תלוי כי ההפרדה בין המוח הקטן לחתוך את שתי ההמיספרות הוא בניצב על פני השטח טבלה). החוקר אשר מבצע culturing SCN יכול לחוות תרבויות SCN לא להתנדנד בשלב אחד עם השני. תרגול סטנדרטיזציה של הטכניקה חיתוך, כלומר את הפרוסות נחתכות תמיד ברמה rostro-הזנב אותו SCN, תשפר את התוצאה.
צעדים קריטיים
- אספקת החמצן הוא קריטי.
מכיוון שהמוח דורש הרבה חמצן 22, ההליך חיתוך צריך להיות מהיר (ככל 3.1-3.10 הוא ~ 5-6 דקות זה יותר טוב כדי לשמור על הרקמה הבריאה). - SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה וחילופי בינוני.
SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה הטמפרטורה גדול יכול להסיט את שלב קוצב לב ולגרום ממצאים ניסיוניים 23. אם בינוני או פתרונות מוחלפים או הוסיף במהלך ניסוי מתמשך, למשל כאשר החלים תרופה אחרי כמה ימים בתרבות, הבינוני או solution צריך להיות מחומם מראש ל 36-37 ° C (הטמפרטורה זהה בתא) לפני כן. בניסויים פרמקולוגיים הכוללים חילופי בינוני, חשוב תמיד לעבוד עם מדיום מראש מותנה תרבית תאים. תוספת / לשטוף החוצה עם טרי, בינוני מותנית עלולה שלב משמרת את הקצב SCN מולקולריים 24, כמו גם סוג תא אחר תרבויות 25. - בינוני הרכב.
חשוב בתרבות רקמות pH osmolality הנכונים. בינוני אוויר חציצה מכיל כמות גדולה של HEPES, אשר בעל קיבולת חיץ אופטימלי בטווח של 6.8-8.2 pH ו מתאים גם חציצה השינויים pH שעלולות להתרחש כתוצאה הנשימה בתא. HEPES, מצד שני, הוא רגיש יותר לשינויי טמפרטורה לעומת סודיום ביקרבונט, הכלולה בכמויות קטנות ובינוניות התרבות. סודיום ביקרבונט בעל קיבולת חציצה גדולה יותר ב-pH נמוך יותר (5.1-7.1) טווח 26, המתאימה ובכך באווירה CO 2. עם זאת, כמויות גדולות יותר של סודיום ביקרבונט במדיום אוויר חציצה (DMEM 2902) מגדילה את osmolality משמעותית ולא ניתן להוסיף בו זמנית ללא דילול בינוני, שבתורה גוררת בהרכב נכונה של חומצות אמינו, ויטמינים יונים.
עצות להכנת בינוני:- הייה מדויק וזהיר כאשר ערבוב הבינוני.
- השתמש פתרונות מניות טרי או מופשר רק עתה.
- במקרה של osmolality גבוהה מאוד זה לא שווה דילול. יותר מ 5-6%, בדילול בינוני סביר להניח שלא לעבוד. שימוש D-גלוקוז להגדיל osmolality אם היא נמוכה מדי.
- שלב משמרות עקב זמן ההכנה
זמן הכנה פרוסה היא קריטית. השפעה מינימלית על אפס או שלב מתקבל אם ההליך פרוסה מתבצע בין ZT דצמבר 06-12. והניתוחים כל פרוסה צריכה להתבצע בשלב זהה של מחזור יומי או היממה כדי למזער שגיאות עקב וריאציה בין שלב ההכנות.
שינויים אפשריים
- עבור electrophysiology SCN חריפה, החיתוך צריך להתבצע עם Ringer (מלאכותית נוזל השדרה Cerebro; ACSF) חוצץ, רווי חמצן (95% O 2, 5% CO 2) לפני תחילת חיתוך. יתר על כן, חמצן צריך להוסיף ברציפות למאגר במהלך ההליך כולו חיתוך, כמו הפעילות החשמלית הסינפטי תלויה ישירות על אספקת חמצן 22.
- פרוסות אופקי sagittal יכול גם להיות מוכנים בהצלחה תרבותי של SCN. המחברים יש ניסיון עם הקלטות בלוציפראז ב פרוסות אופקיות, אשר על פי הניסיון שלנו לתת תנודות היממה עם משרעת נמוכה יותר בהשוואה לחתוך את העטרה.
- SCN הוא כ 1 מ"מ ארוך rostro-caudally ואת טכניקת חיתוך המתואר כאן הוא ממוקד כלפי רכישת סעיף SCN באזור המרכז. עם זאת, אחד או יותר סעיף SCN ניתן להשיג עכבר מוח החולדה, המאפשר חקירה של ביטוי גנים / חלבונים היממה ברמות מקורי יותר מול הזנב של הגרעין SCN.
- תרבויות Slice מבעלי חיים הצעיר, הגורים לאחר הלידה, או אפילו עוברים, יכול גם להיות מוכנים. שים לב המוח לגולגולת גורים צעירים מאוד רכים מאוד רגיש. בנוסף, עצב הראייה הוא דק ולא מפותחת. קח זהירות בעת לנתח את המוח של הגורים כל כך את האזור SCN אינו פגום. למשל, מיקרו כלים rongeur לא ניתן להשתמש כדי לפתוח את הגולגולת של גורים העכבר כי הם גדולים מדי. מספריים פיין הם מספיק כדי לחתוך את הרקמות הרכות של גורים צעירים.
- הזכוכית המכסה טכניקה המבוססת תרבות המתואר כאן יכול לשמש גם כדי הארה תמונה באמצעות מצלמה CCD / EM-CCD, גם בנוירונים SCN יחיד.
- באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית ורקמות איברים מן הפריפריה מהונדס PER2:: בעלי חיים לוק יכול בקלות לקבל, תרבותי ניתח במונחים של תנודות מולקולריות, כמו PER2: הביטוי לוק ממשיך להתנדנד במשך ימים רבים גם במספר רקמות אחרות תא 10 סוגים. רוב אלה ברקמות הפריפריה, על הכבד, למשל, אינם דורשים קרום להישרדות אך במקום מתורבת טובל ישירות 11 בינוני. שים לב כי בשלב הסטה עקב חתך, culturing וחילופי בינוני לא יכול לעקוב אחר אותם עקרונות כמו SCN.
משמעות
בשנת עכבר מהונדס ועל זני חולדה (mPER2: לוק; mPer1 לוק 8, 10, 27) פעילות האנזים בלוציפראז משקף חלבון או ביטוי גנים מקצבים ניתן להעריך על ידי הקלטה פליטת אור. פליטת אור בלוציפראז שנוצר נותן אות חלש אבל הארה הרקע הוא קרוב לאפס, מה שהופך שיטה זו יתרון. יתר על כן, כי המולקולה אינה יציבה בלוציפראז ו מושפל במהירות יש ph לאototoxicity, אשר יכול להופיע במהלך תאורה לטווח ארוך מעורר 28. יחדיו, תכונות אלו מאפשרות לטווח ארוך ביצוע ניסויים בטכנולוגיה כתב בלוציפראז יתרון מאוד במחקר היממה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; יסודות Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, מרתה Lundqvist ו סיגורד och אלזה Goljes Minne; חברה שוודית לרפואה SLS-95151. פרופ 'ג'ין ד בלוק, UCLA, היא הודתה בהכרת תודה על הערות מועילות על כתב היד. אנו מודים ד"ר מיכאל Andäng וד"ר הלנה Johard עבור חוסם את הערוץ HCN, פרופ 'עבד אל Manira לאספקת מיקרוסקופ וידאו.
שיקולים אתיים:
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי קרולינסקה Institutet ו "Norra של שטוקהולם Djurförsöksetiska Nämnd". כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעות מתוך כוונה למזער את כל הלחץ האפשרי או חוסר נוחות לבעל החיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Cover glasses | Menzel-Glaser | 40#1 | ≈ 40 mm |
| Culture membranes | EMD Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma-Aldrich | D2902 | Powder for 1L |
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | ≈ 55 mm |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μmPolyethersulfone |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 |
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | 100 ml |
| HBSS 10x | Invitrogen | 14065-049 | 500 ml |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen | 25080-060 | 50 ml |
| Luciferin | Promega Corp. | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | |
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen | 15140-122 | 100 ml |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm |
| PMT | Hamamatsu Corp. | H9319-11MOD | |
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 09-761-5 | |
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | |
| Vibratome | Campden Instruments |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
