成体マウス視床下部視交叉上核(SCN)、そして文化への迅速な方法器官培養条件下でのSCNの組織を含む準備スライス、の手順が報告されています。さらに、動的なルシフェラーゼレポーターの技術を使用して振動時計遺伝子のタンパク質発現の測定が記述されています。
生理学と行動で毎日のリズムを調整する中心的な概日リズム(〜24時間)クロックは、視床下部前部にある視交叉上核(SCN)に存在する。クロックは、直接網膜と視神経を介して光によって同期化されます。概日振動は、 周期 ( 単位 )の遺伝子を含む、いわゆる"時計遺伝子"と、そのタンパク質産物の数、負のフィードバックループを相互作用によって生成されます。コアクロックはまた、膜の脱分極、カルシウムやキャンプ1に依存しています。 SCNは、時計遺伝子の発現、代謝活性と自発電気活動の毎日の振動を示しています。驚くべきことに、この内因性の周期的活動は、SCN 2-4の成体組織スライスに保持されます。この方法では、体内時計は簡単にペースメーカー機能の分子、電気生理学的及び代謝の研究を可能にする、in vitroで研究することができます。
SCNは、右の視交叉5の上方に位置する小規模な、よく定義された二国間の構造体です。ラットでは、それぞれの核に〜8.000ニューロンが含まれており、約947ミクロン(長さ、rostrocaudal軸)× 424μmの(幅)× 390μmの(高さ)6の寸法を有する。それは、SCNを識別することができる脳の特定のレベルでの脳のスライスをカットするために必要なSCNを分析する。ここで、我々は、マウスやラットの脳についても同様であるSCN、の解剖とスライスの手順を説明します。さらに、我々はどのように膜7、山崎らによってSCNの組織培養用に開発された技術上organotypically解剖組織培養に示す。8。最後に、我々は、動的なルシフェラーゼレポーターテクノロジー、もともとGeusz ら概測定に使用されたメソッドを使用して時計遺伝子/タンパク質の発現を測定するために使用する方法をトランスジェニック組織を示しています。9。 :我々はトランスジェニックノックインPERIOD2からSCN組織をここでを使用してください:。ユジンらが生成されるルシフェラーゼマウス10。マウスは、PERIOD(PER)の融合タンパク質を含んで2とホタルの酵素ルシフェラーゼ。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を触媒するときにルシフェラーゼの基質の存在下で翻訳されている場合PER2、すなわちルシフェリン、PER2の発現を生物発光として監視することができます。放出されるフォトンの数は、積極的に生産さPER2蛋白質の量に相関し、そして生物発光リズムは生体 10 で PER2蛋白質のリズムと一致している。この方法ではPER2の発現の周期的な変動が継続的に多くの日中にリアルタイムに監視することができます。我々は組織培養とリアルタイムの生物発光のレコーディングに従うプロトコルは、徹底的に山崎と高橋11で記載されている。
ルシフェラーゼレポーターの技術を持つメリットとデメリット
昼間の勉強するために多くの異なる時点(サンプリング周波数に応じて、通常2-4時間の低時間分解能を与える)で組織採取を必要とするin situハイブリダイゼーション及びウエスタンブロットで 、このようなRT – PCRなどのex vivoでの方法とは対照的に、遺伝子と蛋白質の表現の変化、ルシフェラーゼレポーター技術は、高解像度(1-10分)と同じ準備で何日も概日振動の研究をすることができます。したがって、使用する動物の数は最小限に抑えられ、リズムの位相と周期への影響の詳細な研究は、通常、低時間分解能と、従来のサンプリング技術を利用可能ではない、実現可能である。しかし、リズムの相対的な振幅の測定が可能であるが、それはレポーター技術は定量的でないため、転写された遺伝子または翻訳されたタンパク質の量を測定するために使用することができないことが強調されるべきである。
組織の記録は、器官SCNの文化は成人の脳の長期的な(週)薬理学的操作を可能に開始し、直ちに培養、直接生体内光誘起位相シフトなどで 、 生体のストレスでの分子の影響を研究するための大きな利点の後に分析することができます無傷の成熟したシナプスのネットワークとルシフェラーゼレポーターの技術を含む組織は、何週間も安定した記録が可能になります。したがって、組織が健全な文化を得るために新生児または出生後早期にする必要はありません、と急性スライス慢性の薬理学的治療とは対照的に行うことができます。エピジェネティックな変化が検討される場合はないゲノムへのDNAの取り込みにつながるか細胞培養におけるプラスミド – レポータートランスフェクション、とは対照的に、トランスジェニックルシフェラーゼ – 動物モデル(だけでなく、レンティ-ウイルスのトランスフェクション)が良好である。それはこの文脈でも発光イメージングは、レコーディングにも概日リズムを研究の主要な研究室によって利用される単一のSCNのニューロン(〜60から10ミクロン)や他の細胞型、許されるように、高感度CCDカメラ11で、今日可能であることが述べられるべきである。最後に、いくつかの概日研究者は、一般的に時計遺伝子/蛋白質の振動16-19を勉強するために、そのような緑色蛍光タンパク質として、他のレポーターを用いた分子の発現のモニタリングを使用してください。
スライス厚の側面
必要に応じて、ここで推奨SCNのスライス(200〜300ミクロン)の厚さが減少または増加させることができた。組織の文化の中で数日後に膜に平坦化するが、しかし、、それは組織7の実行可能性を維持するために最初にカットスライスの500μmの厚さを超えることは推奨されません。が100μmよりも薄いスライスは取り扱いが困難機械的および実際的な理由からです。 SCNの組織が不均質であるため、SCN(例えば、"シェル"と"コア"、と背比べ腹側の領域)内の異なる領域が異なる位相で振動するので、スライスの厚さは、ルシフェラーゼの出力信号の位相に影響を及ぼす可能性がありますフェーズの後に20と差動再同期は、21をシフト。より多くの組織は、光子の大きい数を発するので、スライスの厚さも光子数のベースラインに影響を与えます。分子振動の振幅は、このように間接的に植の大きさによって影響を受ける可能性があります。これらの理由から、制御と処理培養物は、常に同じ大きさ、厚さであることと同じ位相で、同じ振幅で発振するために、SCNの同じ領域を含む必要があります。 two一方的な核は、その一方で、ビブラトームカットが順番に小脳と二つの半球の間に切断分離が垂直であることに依存している水平方向と(角度がない限り、お互いにと同様の振幅と位相で振動するテーブルの表面に)。 SCNの培養を行う研究者は、SCNの文化は互いに位相で発振しないことが発生する可能性があります。練習とスライシング技術の標準化、スライスは常にSCNの同じrostro -尾レベルでカットされている、すなわち、結果が改善されます。
重要なステップ
実行可能な変更
意義
トランスジェニックマウスとラット系統(:mPER2:LUC、mPer1 – lucを8、10、27)でルシフェラーゼ酵素活性は、タンパク質や遺伝子発現のリズムを反映し、生物発光の記録によって評価することができる。ルシフェラーゼによって生成される生物発光は、微弱な信号を与えるが、バックグラウンド発光は、この方法が有利なこと、ゼロに近いです。また、ルシフェラーゼ分子は不安定で速やかに分解されるためにはpHはありません長期的な興奮照明28の間に表示される可能性難聴、。一緒に、これらのプロパティは、概日研究において非常に有利なルシフェラーゼレポーターの技術を作る長期的な実験を可能にする。
The authors have nothing to disclose.
FONCICYT 000000000091984; Jeansson、セーデルストレームKönigska sjukhemmet、マーサLundqvistさんとシグルドOCHエルザの基礎この作品は、スウェーデンの医学研究評議会(K2009 – 75SX – 21028〜01 – 3、K2008 – 61X – 20700〜01 – 3)によって賄われていたGoljesミンヌ、および医学SLS – 95151のスウェーデンの社会。教授ジーンD.ブロック、UCLAは、感謝して原稿上で貴重なコメントで知られています。我々はビデオ顕微鏡を提供するための博士マイケルAndäng博士とヘレナJohard HCNチャネルブロッカーのため、教授とアブデルエルManiraに感謝する。
倫理的配慮:
動物のすべての実験はカロリンスカ研究所と"ストックホルムのノーラDjurförsöksetiska Nämnd"で定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。全ての動物実験は、動物へのあらゆる可能なストレスや不快感を最小限に抑える目的で行われます。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
Vibratome | Campden Instruments |