성인 마우스 hypothalamic suprachiasmatic 핵 (SCN), 그리고 문화에 빠른 방법 organotypic 문화 상태에있는 SCN의 조직을 포함 준비 슬라이스의 절차가보고됩니다. 또한, 동적 루시페라제 리포터 기술을 사용하여 oscillatory 시계 유전자 단백질 표현의 측정이 설명되어 있습니다.
생리와 행동의 일상 리듬을 조정 중앙 circadian (~ 24 시간) 시계 앞쪽에 시상 하부에있는 suprachiasmatic 핵 (SCN)에 있습니다. 시계는 직접 망막과 시신경을 통해 빛이 의해 동기화됩니다. Circadian oscillations는 시대 (당) 유전자를 포함하는 소위 "시계 유전자"와 그들의 단백질 제품의 여러 부정적인 피드백 루프를 상호 작용에 의해 생성됩니다. 코어 클럭은 멤브레인 탈분극, 칼슘 및 캠프 1에 따라 달라집니다. SCN은 시계 유전자 발현, 신진 대사 활동과 자발적인 전기적 활동에 매일 oscillations을 보여줍니다. 현저하게,이 내생 순환 활동 SCN 2-4 성인 조직 슬라이스에 지속. 이러한 방법으로 생물 학적 시계는 쉽게 맥박 조정기 함수의 분자, electrophysiological 및 신진 대사 조사를 허용, 체외에서 공부하실 수 있습니다.
SCN 바로 광학 chiasm 5 위에있는 작은, 잘 정의된 양자 구조입니다. 쥐에서는 각 핵에서 ~ 8.000 뉴런을 포함하여 약 947 μm의 (길이, rostrocaudal 축) × 424 μm의 (폭) × 390 μm의 (높이) 6 규격이 있습니다. 그것은 SCN이 확인할 수 있습니다 두뇌의 특정 수준에서 뇌 슬라이스를 잘라하는 데 필요한 SCN을 해부하다합니다. 여기서는 마우스 및 쥐 머리가 비슷합니다 SCN의 해부와 깔끔히 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 어떻게 막 7, 야마자키 외 의해 SCN 조직 문화의 개발 기술에 organotypically 해부하는 조직 문화를 보여줍니다. 8. 마지막으로, 우리는 유전자 변형 조직은 시계 유전자 / 동적 루시페라제 리포터 기술, 원래 Geusz 외 의해 circadian 측정에 사용된 방법입니다. 9를 사용 단백질의 표현을 측정하는 데 사용할 수 방법을 보여줍니다. 우리는 여기서 유전자 변형에서 SCN의 조직을 사용하는 PERIOD2 인 노크 : 유 외 제작한 루시페라제 쥐 10.. 마우스는 시대의 융합 단백질 (당) 2 반딧불의 효소 루시페라제가 포함되어 있습니다. 루시페라제은 luciferin의 산화를 catalyzes 때 PER2가 루시페라제 즉, luciferin을위한 기판의 존재로 번역하면 PER2 표현식은 bioluminescence으로 모니터링할 수 있습니다. 방출 광자의 개수는 긍정적으로 생산 PER2 단백질의 금액에 상호 및 bioluminescence 리듬은 생체내 10 PER2 단백질 리듬을 일치합니다. 이런 방식으로 PER2 표현의 주기적 변화는 지속적으로 며칠 동안 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 우리가 조직 culturing 실시간 bioluminescence 기록에 대한 수행 프로토콜은 철저하게 야마자키와 다카하시 11 설명했습니다.
루시페라제 리포터 기술과 장점과 단점
낮의를 공부하기 위해서는 여러 시간 포인트 (샘플링 주파수에 따라 일반적으로 2-4 시간의 낮은 시간 해상도를 제공)에서 조직 샘플을 필요로 원위치 하이브리드화과 서양 얼룩 이러한 RT – PCR로 전직 생체내 방법, 달리 유전자와 단백질 표현의 변화, 루시페라제 리포터 기술은 높은 해상도 (10-10 분) 같은 준비에 많은 일 동안 circadian oscillations의 연구를 수 있습니다. 리듬의 위상 및 기간에 대한 효과 그러므로, 사용하는 동물의 수를 최소화하고 상세한 연구는 일반적으로 낮은 시간 해상도로 기존의 샘플링 기법을 사용 불가능한지, 가능합니다. 리듬의 상대 진폭 측정이 가능 있지만 그러나, 그것은 기자의 기술은 양적하지 않으며 따라서 베꼈는데 유전자 또는 단백질 번역의 양을 측정하는 데 사용할 수 없다는 것을 강조해야합니다.
조직 녹음 organotypic SCN 문화는 성인 뇌의 장기 (주) 약리 조작을 허용하기 시작하고 즉시 culturing, 직접 생체내 빛을 유도 위상 교대 등, 생체내 스트레스의 분자 효과를 공부에 대한 큰 장점 후 분석할 수 손상 성숙한 신경 네트워크와 루시페라제 리포터 기술을 포함하는 조직은 여러 주 동안 안정적인 레코딩이 가능합니다. 따라서 조직은 건강한 문화를 얻기 위해서는 신생아 또는 출생 후의 초기 필요하지 않으며, 급성 만성 슬라이스 약리 치료와는 대조적으로 수행할 수 있습니다. epigenetic 변경은 연구해야하는 경우없이 염색체에 DNA의 결합으로 이어질 할 셀 문화에 플라스미드 – 기자 transfections, 대조적으로, 유전자 변형 루시페라제 – 동물 모델 (뿐만 아니라 lenti 바이러스 transfections)이 유리합니다. 그것은이 상황에서도 발광 이미징은 녹음도 circadian 리듬을 공부 전공 실험실로 활용 단일 SCN의 뉴런 (~ 60-10 μm의)와 다른 세포 유형에 있으므로, 매우 민감한 CCD 카메라 11 요즘 가능하다는 것을 언급해야합니다. 마지막으로, 여러 circadian 조사는 일반적으로 시계 유전자 / 단백질 oscillations 16-19를 공부하기 위해서는 이러한 그린 형광 단백질과 같은 다른 기자를 사용하여 분자 표현의 모니터링을 사용합니다.
슬라이스 두께의 측면
여기에서 권장하는 SCN 슬라이스 (200-300 μm의)의 두께가 감소하거나 원할 경우 증가 수 있습니다. 조직 문화의 몇 일 후에 막에 나가 flattens하지만 그러나, 그것은 조직 7 생존을 보존하기 위해 처음 컷 단면 500 μm의 두께를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 100 μm의보다 얇은 슬라이스가 처리하기 어려운 기계 및 실질적인 이유입니다. SCN (예를 들어 '껍질', 그리고 지느러미 대 복부 지역 대의 "핵심") 이내에 다른 지역은 다른 단계와 함께 진동 SCN 조직 이질 때문에 슬라이스의 두께가 루시페라제 출력 신호의 위상에 영향을 미칠 수, 이후 20 differentially이 단계 이후에 다시 동기화 21 교대. 더 많은 조직이 광자의 큰 숫자를 방출 이후 슬라이스의 두께는 광자 개수의 기준에 영향을 미칩니다. 분자 oscillations의 진폭이 방식으로 간접적으로 explant의 크기에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 이유로, 제어 및 치료 문화는 항상 같은 크기, 두께가 같은 위상과 같은 진폭과 진동하기 위하여 SCN의 동일한 영역을 포함해야합니다. 두 일방적 핵은 반면에, 서로와 한 유사한 amplitudes와 단계에 진동 vibratome 컷 (차례로 소뇌와 두 반구 사이의 절단 분리는 직각입니다에 의존하는 직각 수평이 아니므로 테이블 표면). SCN의 culturing을 수행하는 조사는 SCN의 문화가 서로 단계에서 진동하지 않는 경험을 할 수도 있습니다. 연습과 깔끔히 기술의 표준화, 조각은 항상 SCN의 동일한 rostro – 꼬리 수준 버렸어요 즉, 결과를 향상됩니다.
중요 단계
가능한 수정
의미
유전자 변형 마우스 및 쥐 종자 (mPER2 : 륙, mPer1 – 륙 8, 10, 27)에서 루시페라제 효소 활동은 단백질이나 유전자 발현의 리듬을 반영하고 bioluminescence 기록에 의해 평가하실 수 있습니다. 루시페라제 생성된 bioluminescence는 약한 신호를 제공하지만 배경 발광이 방법이 유리하고, 제로에 가까운 것입니다. 또한, 루시페라제 분자가 불안정하고 급속하게 저하되기 때문에 PH가 없습니다장기적인 흥분성의 조명 28 동안 나타날 수 있습니다 ototoxicity. 함께 촬영이 속성은 circadian 연구 루시페라제 리포터 기술이 매우 유리하게 오랫동안 실험 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
FONCICYT 000000000091984,, Jeansson의 기초, Söderström Königska sjukhemmet, 마사 Lundqvist 및 시거드 루시 엘사이 작품은 스웨덴 의학 연구 협의회 (K2009 – 75SX – 21028-01 – 3, K2008 – 61X – 20700-01 – 3)에 의해 추진하는 사업 Goljes 민, 그리고 의약 SLS – 95151의 스웨덴어 학회. 교수 진 D. 블록, UCLA는 기꺼이 원고에 대한 귀중한 의견을 인정받고 있습니다. 우리는 비디오 현미경 제공을위한 HCN 채널 차단에 대한 박사 마이클 Andäng 및 박사 헬레나 Johard 감사하고, 교수 압델 엘 – Manira.
윤리적인 고려 사항 :
동물의 모든 실험은 Karolinska Institutet와 "스톡홀름의 Norra Djurförsöksetiska Nämnd"에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 모든 가능한 응력이나 동물에 불편을 최소화하기 위해 의도로 수행됩니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
B27 supplement 50x | Invitrogen/Gibco | 17504-044 | ||
Cover glasses | Menzel-Gläser | 40#1 | ≈ 40 mm | |
Culture membranes | Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm | |
DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma | D2902 | Powder for 1L | |
Filter paper | Whatman | 1003 055 | ≈ 55 mm | |
Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μm Polyethersulfone | |
Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 | |
HEPES | Invitrogen/Gibco | 15630-056 | 100 ml | |
HBSS 10x | Invitrogen/Gibco | 14065-049 | 500 ml | |
NaOCH3 7.5% | Invitrogen/Gibco | 25080-060 | 50 ml | |
Luciferin | Promega | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt | |
Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | ||
PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | 100 ml | |
Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm | |
PMT | Hamamatsu | H9319-11MOD | ||
Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 | |
Vacuum filter | Fisher | 09-761-5 | ||
Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | ||
Vibratome | Campden Instruments |