Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano angepasst
Abstract
Mitochondrien sind Organellen Steuerung der Leben und Tod der Zelle. Sie in wichtigen Stoffwechselreaktionen beteiligt, synthetisieren die meisten der ATP, und regeln eine Reihe von Signalkaskaden 2,3. Vergangene und gegenwärtige Forscher haben isolierte Mitochondrien aus Ratten und Mäusen Gewebe wie Leber, Gehirn und Herz 4,5. In den letzten Jahren haben viele Forscher auf die Untersuchung der mitochondrialen Funktion von Skelettmuskeln konzentriert.
Hier beschreiben wir eine Methode, die wir erfolgreich für die Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskeln 6 verwendet. Unser Verfahren erfordert, dass alle Puffer und Reagenzien hergestellt sind frisch und müssen etwa 250-500 mg der Skelettmuskulatur. Wir untersuchten Mitochondrien aus Ratte und Maus gastrocnemius und Zwerchfell isoliert und Ratte Augenmuskeln. Mitochondriale Protein-Konzentration wird mit dem Bradford-Assay gemessen. Es ist wichtig, dass die mitochondriale Proben aufbewahrt eiskalt während der Vorbereitung und funktionelle Studien in relativ kurzer Zeit (~ 1 h) durchgeführt werden kann. Mitochondriale Atmung gemessen mittels Polarographie mit einer Clark-Elektrode (Oxygraph System) bei 37 ° C 7. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden. Isolierte Mitochondrien (150 ug) sind bis 0,5 ml der experimentellen Puffer (EB) aufgenommen. State 2 Atmung beginnt mit Zusatz von Glutamat (5mm) und Malat (2,5 mM). Dann wird Adenosindiphosphat (ADP) (150 nM) zugegeben, um den Zustand 3 zu beginnen. Oligomycin (1 pM), einer ATPase-Synthase-Blocker, wird verwendet, um den Zustand 4 zu schätzen. Schließlich Carbonyl Cyanid p-[Trifluormethoxy]-phenyl-Hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wird zugegeben und 5 measurestate oder abgekoppelt Atmung 6. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV), das Verhältnis von Staat 3 bis Zustand 4 wird nach jedem Experiment berechnet. Ein RCR ≥ 4 wird als Beweis für eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung berücksichtigt.
Zusammenfassend stellen wir eine Methode zur Isolierung von lebensfähigen Mitochondrien aus Skelettmuskeln, die in biochemischen (zB Enzymaktivität, Immundetektion, Proteomik) und funktionelle Untersuchungen (mitochondriale Atmung) genutzt werden können.
Protocol
1. Herstellung der Puffer
- Schalten Sie Zentrifuge 5804R und auf 4 ° C. Schalten Sie Isotemp 3006D Wasserbad und auf 37 ° C.
- Stellen Sie folgende Lösungen vor Muskel-Isolation:
- PBS: Lösen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Tabletten in destilliertem Wasser (5 Tabletten / Liter). Gut mischen.
- PBS plus 10 mM EDTA: So bereiten Sie eine 100 ml-Lösung, 2 ml 500 mM EDTA und 98 ml PBS.
- 8X Mitochondrien Puffer: 10,28 g Saccharose für eine Endkonzentration von 0,6 M, 400 mg der freien Fettsäuren Rinderserumalbumin (BSA) für eine Endkonzentration von 0,8%, 2,08 g HEPES für eine Endkonzentration von 160 mM, pH auf 7,4 und QS auf 50 ml mit destilliertem Wasser.
- Isolation Buffer 1 (IB1): In 200 ul 500 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 10 mM, 0,392 g D-Mannitol zu einer Endkonzentration von 215 mM, 1,25 ml 8X Mitochondrien-Puffer, pH auf 7,4 und QS bis 10 ml mit destilliertem Wasser.
- Isolation Buffer 2 (IB2): In 60 ul 500 mM EGTA für eine Endkonzentration von 3 mM, 0,392 g D-Mannitol zu einer Endkonzentration von 215 mM, 1,25 ml 8X Mitochondrien-Puffer, pH auf 7,4 und QS bis 10 ml mit destilliertem Wasser.
- Experimentelle Buffer (EB): 100 l von 500 mM MgCl 2 für eine Endkonzentration von 5 mM, 0,392 g D-Mannitol zu einer Endkonzentration von 215 mM, 25 ul von 2,5 mM KH 2 PO 4 für eine endgültige Konzentration von 6,25 pM, 2 ul 100 mM EGTA für eine Endkonzentration von 20 uM, 1,25 ml der mitochondrialen Puffer, pH auf 7,4 und QS bis 10 ml mit destilliertem Wasser.
2. Muscle Isolation
- In einem Eiskübel, legte drei 10 ml-Becher, Potter-Elvehjem Gewebe Mühlen und alle anderen notwendigen Instrumente / supplies auf Eis. Alles muss bleiben eiskalt während des gesamten Experiments.
- Legen Sie IB1 und IB2 in Eiskübel und EB in warmen Wasserbad, wenn Sie fertig.
- In den drei 10 ml Becher, sollten die folgenden Lösungen gegeben werden:
- Beaker 1: 10 ml PBS
- Beaker 2: 10 ml PBS / EDTA
- Beaker 3: 3 ml IB1
- Tötet eine Ratte menschlich wie von Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
- Schnell isolieren 250-500 mg der Skelettmuskulatur, spülen Sie im Becherglas 1, dann Becherglas 2 übertragen.
3. Homogenisierung / Mitochondrial Isolation
- Transfer-Muskel Beaker 3 und fein hacken den Muskel mit einer Schere.
- Übertragen Sie die Lösung für die Potter-Elvehjem Homogenisator. Homogenisieren der Muskel mit einem motorisierten Stößel (einer Bohrmaschine wird die Arbeit zu tun) 10-mal halten den Schlauch in Eis zu allen Zeiten.
- Transfer-Homogenat zu vorgekühlte 2 ml Reaktionsgefäße und Zentrifuge bei 700 g für 10 Minuten bei 4 ° C.
- Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Discard Pellet.
- Centrifuge Überstand bei 10.500 g für 10 Minuten bei 4 ° C.
- Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und Label SN1 (Überstand Nummer 1) und Muskel-Typ.
- Re-suspend Pellet in 500 ul IB2.
- Zentrifuge bei 10.500 g für 10 Minuten bei 4 ° C.
- Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und Label SN2 (Überstand Nummer 2) und Muskel-Typ.
- Suspend letzten mitochondriale Pellet in 100 ul IB2.
- Re-Spin-Finale mitochondrialen Suspension in Minifuge für ein paar Sekunden. Wenn es eine Pellet-, Transfer Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets.
- Bestimmen Sie Proteinkonzentration mit der Bradford-Assay 8.
4. Kalibrierung der Elektrode
HINWEIS: Vollständige Kalibrierung der Elektrode während der mitochondrialen Isolation.
- 100 ml destilliertem Wasser auf 250 ml Flasche. Lang kräftig für 20 Minuten, um das Wasser mit Luft-Gas-Gleichgewicht zu bringen.
- Fügen Sie ein paar Tropfen 50% KCl zur Oxygraph Elektrode.
- Legen Sie ein kleines Stück von Blue Rizla Zigarettenpapier auf der Elektrode.
- Legen Sie ein Stück PTFE-Membran auf der Oberseite des Zigarettenpapier.
- Wenden Sie den inneren Ring mit dem Ring-Applikator und platzieren Sie dann den Außenring in die Elektrode Nut.
- Connect Elektroden und montieren den Rest der Ausrüstung: größer Kunststoffring Basis mitochondrialer Kammer und Wasserschläuchen.
- Schalten Sie Oxygraph Boxen und starten Oxygraph Software.
- Fügen Sie die äquilibriert Wasser mitochondrialen Kammer.
- Add Rührstab und schalten Sie auf eine Geschwindigkeit von 60 Jahren.
- Beginnen Sie ein neues Experiment.
- Klicken Sie auf Kalibrieren und dann flüssigen Phase Kalibrierung für Box 1. Ändern Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf "OK" zweimal.
- Als "Override" auf "OK" klicken, und öffnen Sie die Stickstoff-Tank.
- Platzieren Sie die Spitze verbundenStickstoff-Tank in die Kammer und zu etablieren Null Sauerstoff. Klicken Sie auf "OK", wenn sie von Schaltern "Override".
- Saugen Sie Wasser und fügen Sie 500 ul der EB-Puffer zur mitochondrialen Kammern.
- Seal Kammer mit Kolben.
- Bei Verwendung mehrerer Boxen, wiederholen Sie die Schritte 11-15 für die Kalibrierung von Box 2.
5. Mitochondriale Atmung
- Starten Sie ein neues Experiment, lassen Sie es für ca. 1 Minute laufen, um zu signalisieren stabilisieren.
- Add erforderliche Volumen der mitochondrialen Suspension (Schritt 3,11) für 150 ug in jeder Kammer, markieren Veranstaltung und lassen Sie sie für 1 Minute laufen.
- Add 10 pl warmem 250 mm/125 mm Glutamat / Malat für eine Endkonzentration von 5 mM mM/2.5. Mark und für 1 Minute laufen zu lassen. Dies wird als Zustand 2 definiert.
- Add 7,5 ul 10 mM ADP für eine endgültige Konzentration von 150 uM, Marke, und lassen Sie laufen für 30 Sekunden. Dies wird als State 3 definiert.
- Fügen Sie weitere 7,5 ul 10 mM ADP, Marke, und lassen Sie laufen für 1,5 Minuten.
- Add 0,5 ul kaltem 10 mM Oligomycin für eine endgültige Konzentration von 1 nM, Marke, und lassen Sie laufen für 3 Minuten. Dies ist als staatliche 4 definiert.
- Add 1 ul kalter 0,1 mM FCCP für eine endgültige Konzentration von 0,2 uM, Marke, und lassen Sie laufen für 3 Minuten. Dies ist als staatliche 5 definiert.
- Wenn Sie fertig sind, beenden experimentieren und zu speichern.
- Erwerben Atemfrequenz mittels Oxygraph Software.
- Geben Sie Normierungsfaktor: Wenn Zugabe von 150 pg mitochondriale Protein, dem Normierungsfaktor wird 0,15.
- Berechnen normalisiert Atemfrequenz für die verschiedenen Atmung Staaten.
- Berechnen Sie den Respiratory Control-Ratio (RCR), indem State 3 von State 4.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Zeigt eine repräsentative Verfolgung von Sauerstoffverbrauch durch Skelettmuskulatur Mitochondrien. Nach der Elektrode Signal stabilisiert ist, wird die Mitochondrien Probe auf die Oxygraph Kammer aufgenommen. State 2 Atmung beginnt mit Zusatz von Glutamat und Malat. Die Zugabe von ADP steigt der Sauerstoffverbrauch, die Definition Zustand 3 Atmung. ATP-Synthase wird durch Zugabe von Oligomycin blockiert, um den Zustand 4 Atmung zu erhalten. Schließlich ist FCCP hinzugefügt, um die mitochondriale Atmung (Zustand 5) zu entkoppeln. Tabelle 1 zeigt repräsentative Sauerstoffverbrauch Preise für die Zustände 2, 3, 4 und 5. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV) ist für jedes Experiment berechnet. RCR ≥ 4 wird als Beweis für eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung berücksichtigt.
Staaten | Normalisierte Preise |
State 2 | 34,74 |
State 3 | 153,40 |
State 4 | 16,49 |
State 5 | 143,70 |
RCR | 9,30 |
Tabelle 1. Mitochondriale Atemfrequenz. Representativeoxygen Verbrauch von Skelettmuskel Mitochondrien. Die Werte sind auf die Höhe der Mitochondrien aufgenommen, um die Kammer normalisiert. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV) wird durch Division Zustand 3 durch staatliche 4 bestimmt. Ein RCR ≥ 4 stellt eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung.
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Discussion
Wir präsentieren ein Protokoll, um lebensfähige Mitochondrien aus Skelettmuskulatur zu isolieren. Wenn Ertrag ist ein Problem, kann das Protokoll durch Inkubation der isolierten Muskel in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin für 30 Minuten in Eis verändert werden. Um sicherzustellen, komplette Muskel-Verdau mit Trypsin, muss der Muskel vollständig zerkleinert werden. Nach dem 30-minütigen Inkubation, muss der PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin-Lösung komplett mit 3 ml der Isolation Puffer 1 (IB1) ersetzt werden. Darüber hinaus kann die Verwendung von Trypsin mit einigen mitochondrialen Substrate während der Atmung Protokoll stören. Alle Substrate in diesem Protokoll führen zu guten mitochondrialen Vorbereitungen bei der Verwendung von Trypsin verwendet.
Für Maus Skelettmuskulatur, ist es am besten, die gastrocnemius Muskeln beider Beine zu kombinieren, oder nutzen Sie die gesamte Membran. Für Ratten Skelettmuskulatur, ist ein kleiner Abschnitt der gastrocnemius oder Membran ausreichend. Übermäßige Muskelmasse kann der Isolierung und führen zu geringeren Renditen erschweren. Für die Isolierung von sehr kleinen Muskeln wie die Augenmuskeln, ist es notwendig, Pool Muskeln von mehr als 1 Tier die notwendigen Muskelmasse zu erhalten.
Dieses Protokoll bezieht sich auf zwei verschiedene Überstände: SN1 und SN2. Diese Überstände sind das Ergebnis der Differential-Zentrifugation und enthalten nicht-mitochondrialen Proteine. Proteine aus diesen Überständen und vom letzten mitochondriale Pellet kann in Western Blots verwendet werden, um die Reinheit der mitochondrialen Vorbereitung zu überprüfen. Western Blots mit mitochondrialen und zytoplasmatischen Antikörper bestätigen die Reinheit des mitochondrialen Vorbereitung in den letzten Pellet.
Reinigung der mitochondrialen Atmung Ausrüstung ist entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Nach jedem Versuch müssen die Kammern gründlich wie folgt gereinigt werden: Spülen Kammern fünfmal mit destilliertem Wasser, einmal gründlich mit 70% Ethanol, Ethanol-löslichen Substraten zu entfernen, spülen Sie mit einer gesättigten Lösung von PBS / BSA für ca. 5 Minuten, schließlich Spülen Kammern 5 mal mit destilliertem Wasser. Clark-Typ Elektroden müssen ordnungsgemäß nach jedem Gebrauch durch Spülen mehrmals mit destilliertem Wasser und weich gewaschenen mit der Zahnbürste gereinigt werden. Dann müssen sie vollständig mit lieh-free Tücher getrocknet und in einem Exsikkator gelagert. Einmal pro Woche sollten die Elektroden poliert mit dem Oxygraph Polierset werden.
Mitochondriale Substrate werden als Stammlösungen hergestellt, aliquotiert und bei -20 o C gelagert Wir empfehlen nicht, die Wiederverwendung von Substraten. Nach unserer Erfahrung sind die meisten Substrate bei -20 o C mehrere Monate stabil, mit Ausnahme von Oligomycin, die ersetzt alle 2 Monate oder so sein muss. Immer auf den Angaben des Herstellers für weitere Informationen verweisen.
Schließlich kann dieses Protokoll auch verwendet, um zu isolieren Mitochondrien von Herz werden. Wie bei anderen Muskeln, wird die Größe des Tieres (Ratte vs Maus) zu ermitteln, welcher Anteil des Organs ist notwendig, um ausreichend Mitochondrien zu erhalten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Eye Institute (R01 EY12998) an der FH Andrade unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
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- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
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- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
